Bacterial Production of Pinene by a Laboratory-Evolved Pinene-Synthase
- 作者
- Miki Tashiro, Hiroshi Kiyota, Shigeko Kawai-Noma, Kyoichi Saito, Masahiko Ikeuchi, Yoko Iijima, Daisuke Umeno
- 单位
- Department of Applied Chemistry and Biotechnology, Faculty of Engineering, Chiba University, 1-33 Yayoi-Ciyo, Inage-ku, Chiba 263-8522, Japan; Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033, Japan; Department of Life Sciences (Biology), Graduate School of Arts and Science, University of Tokyo, 3-8-1 Meguro-ku, Tokyo 153-8902, Japan; Department of Nutrition and Life Science, Kanagawa Institute of Technology, 1030 Shimo-ogino, Atsugi, Kanagawa 243-0292, Japan; Precursory Research for Embryonic Science and Technology (PRESTO), Japan Science and Technology Agency (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama 332-0012, Japan
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2017）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.6b00140
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
单萜合酶（蒎烯合酶）在微生物宿主中因与内源FPP合酶竞争底物GPP以及胞质中Mn2+浓度不足而活性低下，导致蒎烯产量远低于其他萜类。
研究策略
开发基于类胡萝卜素色素减少的高通量筛选系统，通过易错PCR对蒎烯合酶催化结构域进行定向进化，筛选获得GPP消耗能力增强的突变体，并在大肠杆菌和蓝细菌中验证其生产性能。
核心内容
研究者针对蒎烯合酶在微生物宿主中活性低下的问题，开发了基于类胡萝卜素色素减少的表型筛选系统，通过易错PCR对蒎烯合酶催化结构域进行定向进化。筛选获得的突变体PSmut（H346Y/Q457L）改变了金属辅因子偏好，使其在Mg2+高而Mn2+缺乏的大肠杆菌细胞质中仍能维持高活性，体外实验显示仅含Mg2+条件下PSmut活性比野生型高约7倍。在甲羟戊酸途径背景下，PSmut使α-pinene和β-pinene总产量达到140 mg/L，为野生型的两倍，且为此前最高报道值的4.4倍；与GPPS融合表达时总产量进一步提高至150 mg/L。在蓝细菌Synechocystis中，PSmut产量约为野生型的两倍。这项工作首次通过定向进化提高了单萜合酶的体内活性，证明改造金属辅因子偏好是利用原核宿主胞内金属离子环境提升单萜产量的有效策略。
创新点
首次通过定向进化提高单萜合酶活性；建立的筛选系统通过引入FPP合酶调节筛选阈值，适用于单萜合酶；获得的PSmut（Q457L）改变金属辅因子偏好，使其在Mn2+缺乏的细胞质中利用Mg2+维持高活性。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 单萜生物合成 | PS | (-)-α-pinene synthase | 催化 | 来自Pinus taeda，经密码子优化；定向进化获得H346Y/Q457L突变体PSmut，Q457L为关键突变 |
| Escherichia coli | 单萜生物合成 | AgGPPS | geranyl pyrophosphate synthase | 催化 | 来自Abies grandis，用于提供GPP |
| Escherichia coli | 单萜生物合成 | ispA(S80F) | farnesyl pyrophosphate synthase mutant | 催化 | 大肠杆菌内源IspA的S80F突变体，增强GPP积累 |
| Escherichia coli | MEP途径 | dxs, idi | Dxs, Idi | 催化 | 来自pBBRSOE6质粒，强化DMAPP/IPP供给 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | atoB, hmgs, hmgr, MK, PMK, PMD, idi | MEV pathway enzymes | 催化 | 来自pJBEI-6409衍生的pMEV-idi质粒，提高前体供给 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成（C30） | crtM, crtN | CrtM, CrtN | 催化 | 来自Staphylococcus aureus，用于高温量筛选中的色素可视化 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成/单萜竞争 | BstFPPS | farnesyl pyrophosphate synthase | 催化 | 来自Geobacillus stearothermophilus，用于调节筛选阈值 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 单萜生物合成 | PS | (-)-α-pinene synthase | 催化 | 整合至slr2031位点；PSmut产量为PSwt的两倍 |
| Escherichia coli | 单萜生物合成 | LMS | limonene synthase | 催化 | 来自Mentha spicata，与PS竞争GPP；PSmut仍优于PSwt |
| Escherichia coli | 单萜生物合成 | PS-AgGPPS (fusion) | PS-GPPS fusion protein | 催化 | C端融合效果较好；PSmut-GPPS总产150 mg/L，PSwt-GPPS总产80 mg/L |
关键发现
- 未过表达异戊烯基转移酶时α-pinene产量为4.2 mg/L
- 共表达AgGPPS或IspA(S80F)后产量达到50 mg/L。经一轮诱变筛选获得PSmut（H346Y/Q457L），Q457L为关键突变。在MEP强化背景下PSmut产量为5 mg/L，较PSwt的3 mg/L提高60%。在MEV途径背景下，PSmut产量达140 mg/L（α-pinene 120 mg/L，β-pinene 20 mg/L），是PSwt的两倍，且为此前最高报道值32 mg/L的4.4倍。与LMS共生产时，PSmut产40 mg/L，PSwt为20 mg/L。PS-GPPS融合中，PSwt-GPPS产80 mg/L，PSmut-GPPS产150 mg/L（α-pinene 130 mg/L，β-pinene 20 mg/L），为最高总产量。在蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803中，PSmut产约80 μg/L（168 h），为PSwt（约40 μg/L）的两倍。体外实验表明，仅含Mg2+条件下PSmut活性比PSwt高约7倍
- PSwt在无Mn2+时活性仅为含Mn2+条件的1/25-1/20，而PSmut在仅Mg2+条件下保持60%活性。
研究结论
通过定向进化获得的蒎烯合酶突变体PSmut改变了金属辅因子偏好，使酶在大肠杆菌细胞质（Mg2+高、Mn2+缺乏）中保持高活性，显著提高蒎烯产量，摇瓶培养最高达140 mg/L，在蓝细菌中产量也翻倍。这是首次报道通过定向进化提高单萜合酶产量。