Standardized markerless gene integration for pathway engineering in Yarrowia lipolytica
- 作者
- Cory Schwartz, Murtaza Shabbir-Hussain, Keith Frogue, Mark Blenner, Ian Wheeldon
- 单位
- Chemical and Environmental Engineering, University of California, Riverside; Chemical and Biomolecular Engineering, Clemson University
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2017）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.6b00285
- 所属领域
- 代谢工程; 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）同源重组效率低，缺乏无标记多基因整合工具，传统方法依赖选择标记和标记回收，难以快速稳定地构建产脂/萜类菌株。
研究策略
利用CRISPR-Cas9诱导双链断裂，结合同源供体质粒实现位点特异性无标记基因整合；筛选17个基因组位点，鉴定5个不影响生长且整合效率高的位点；构建5对标准化质粒工具，并应用于番茄红素合成途径的多基因整合。
核心内容
针对解脂耶氏酵母同源重组效率低、缺乏无标记多基因整合工具的问题，本研究开发了一套基于CRISPR-Cas9的标准化无标记基因整合系统。作者利用Cas9诱导双链断裂并结合同源供体质粒，在17个候选基因组位点中筛选出5个不影响生长且整合效率高的位点，其中MFE1、AXP和XPR2的整合效率分别达69±25%、62±10%和48±13%，而部分位点效率低于6%。供体质粒的简化设计使单基因整合仅需4至5天，无需标记回收。将该工具应用于番茄红素合成途径的逐步整合，通过引入HMG1、GGS1或crtE等基因，摇瓶培养4天后番茄红素产量从0.39 mg/g DCW逐步提升至3.38 mg/g DCW，提高了8.6倍；qPCR确认了外源基因的单拷贝整合。这项工作为解脂耶氏酵母提供了高效、可重复的多基因通路工程平台，显著缩短了菌株构建周期。
创新点
首次在Y. lipolytica中建立标准化无标记基因整合工具；鉴定5个高效整合位点并表征其表达水平；供体质粒设计简化了基因克隆；实现多基因同时整合而不需要标记回收，单基因整合仅需4-5天。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica PO1f | — | — | — | — | 底盘菌株，基因型MatA, leu2-270, ura3-302, xpr2-322, axp-2 |
| — | 基因组编辑 | Cas9 | Cas9核酸内切酶 | 催化 | 来自化脓链球菌，经密码子优化，由pCRISPRyl质粒表达 |
| — | 番茄红素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，密码子优化，整合于AXP位点 |
| — | 番茄红素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，密码子优化，整合于XPR2位点 |
| — | 甲羟戊酸途径 | HMG1 | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 内源基因，额外拷贝整合于D17位点 |
| — | 萜类前体合成 | GGS1 | GGPP合酶（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶） | 催化 | 内源基因，额外拷贝整合于A08位点（菌株PO1f HGBI） |
| — | 萜类前体合成 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，整合于A08位点（菌株PO1f HEBI） |
| — | β-氧化 | MFE1 | 多功能酶1 | 催化 | 整合位点之一，破坏后不影响生长，但表达比其他位点低约2.3倍 |
| — | 蛋白分泌 | AXP | 酸性胞外蛋白酶 | 催化 | 整合位点，在PO1f菌株中已敲除 |
| — | 蛋白分泌 | XPR2 | 碱性胞外蛋白酶 | 催化 | 整合位点，在PO1f菌株中已敲除 |
| — | — | A08 | — | — | 假基因整合位点，无已知功能，不影响生长 |
| — | — | D17 | — | — | 假基因整合位点，无已知功能，不影响生长 |
关键发现
- 筛选17个位点，5个位点高效整合：MFE1效率69±25%，AXP 62±10%，XPR2 48±13%，A08 53±33%，D17 52±13%；POX4/E07/XDH效率<6%；KU70缺失使LEU2、XLK、XYR整合率从0提高到7-28%；MFE1位点表达比其他位点低约2.3倍；整合后不影响细胞生长；在YPD10%葡萄糖摇瓶培养4天，PO1f BI番茄红素产量0.39 mg/g DCW，PO1f HBI
- 57 mg/g DCW（1.4倍），PO1f HGBI
- 34 mg/g DCW（3.4倍），PO1f HEBI
- 38 mg/g DCW（8.6倍）；qPCR确认HEBI菌株中crtB、crtE、crtI为单拷贝，HMG1两拷贝，GGS1单拷贝。
研究结论
成功开发了一套基于CRISPR-Cas9的标准化无标记基因整合工具，可在4-5天内完成单基因整合，无标记回收；利用该工具快速构建了产番茄红素的半合成途径，通过整合HMG1、GGS1或crtE等基因逐步提高产量，证明该工具适用于Y. lipolytica多基因通路工程。