A Simple and Universal Method to Express Protein in Unfused form
- 作者
- Tianwen Wang, Aitao Li, Xingyuan Ma, Guocheng Du, Jian Chen
- 单位
- State Key Lab of Food Science and Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; School of Biotechnology, and Stat Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 214122, China
- 杂志
- Protein & Peptide Letters（2012）
- DOI
- 10.2174/092986612802084519
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解决重组蛋白融合表达时附加序列对蛋白性质影响难以预测、且蛋白药物制备需要无融合序列蛋白的问题；提供一种简单通用的不融合表达方法。
研究策略
基于PCR引物设计，在原有融合表达质粒的同一限制性酶切位点之间，通过额外合成一条包含终止密码子和核糖体结合位点（RBS）的正向引物，配合原反向引物扩增目的基因，强制翻译终止，实现蛋白的不融合表达。
核心内容
该研究提出了一种简便通用的重组蛋白不融合表达方法，仅需额外合成一条包含终止密码子和核糖体结合位点的正向引物，配合原反向引物进行PCR扩增，即可在原有融合表达质粒上实现同一目的基因的不融合表达，无需更换载体或添加额外试剂。以源于恶臭假单胞菌的醇脱氢酶（ADH）为模型，研究构建了不融合表达载体并系统比较了融合与不融合ADH的性能。结果显示，不融合ADH的比活力较融合形式提高约4倍，在动力学拆分中，不融合ADH在更高底物浓度（10 mM对2 mM）下12小时即达到>99% ee，而融合ADH需13小时。该方法表达的蛋白不含任何附加氨基酸序列，表达水平不低于融合表达，尤其适用于无需纯化的全细胞催化，为生化研究和蛋白药物制备提供了一种低成本、易操作的新工具。
创新点
仅需额外合成一条引物即可在支持融合表达的质粒上实现同一目的基因的不融合表达，不需要额外载体或试剂；表达的蛋白无任何附加氨基酸序列，且表达水平不低于融合表达；特别适用于无需纯化的全细胞催化。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli T7 | — | adH（GenBank AJ245436） | 醇脱氢酶（ADH） | 催化 | 来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的乙醇脱氢酶，用于验证不融合表达方法 |
| Escherichia coli DH5α | — | — | — | — | 克隆宿主 |
关键发现
- 以来源于Pseudomonas putida的醇脱氢酶（ADH）为例，构建了不融合表达载体。融合ADH与不融合ADH的分子量差异为3.5 kDa（融合肽含34个氨基酸残基）。不融合ADH对底物1-(4-甲基苯基)-1,2-乙二醇的比活力提高了约4倍
- 在动力学拆分中，不融合ADH在底物/催化剂比例更高（10 mM vs 2 mM底物，催化剂均为2 g/L dcw）的情况下，12小时即达到>99% ee，而融合ADH需13小时
- 不融合ADH在30 min时的转化率为38.21%（底物10 mM），融合ADH在30 min时的转化率为48.86%（底物2 mM）。不融合ADH和融合ADH的比活力分别为57.93 U/g.dcw和57.59 U/g.dcw（达到>99% ee时）。
研究结论
开发了一种简单、通用、易得的PCR-based蛋白不融合表达方法，仅需一条新引物即可在原有质粒上实现不融合表达，适用于生化研究、蛋白药物制备及全细胞生物催化。