高级醇 · 代谢工程文献库

← 返回列表

Chemical Synthesis and Expression of a Calmodulin Gene Designed for Site-Specific Mutagenesis

作者
Daniel M. Roberts, Roberto Crea, Marek Malecha, Gabriel Alvarado-Urbina, Ronald H. Chiarello, D. Martin Watterson
单位
Laboratory of Cellular and Molecular Physiology, Howard Hughes Medical Institute, and Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine; Creative Biomolecules, Inc.
杂志
Biochemistry（1985）
DOI
10.1021/bi00340a020
所属领域
合成生物学/蛋白质工程
关键词
E. coli expressionNAD kinasecalmodulingene synthesissite-specific mutagenesis
阅读原文
查看 PDF 原文

解决的核心问题

如何通过化学合成和表达钙调蛋白基因，研究钙调蛋白结构（特别是赖氨酸115甲基化状态）与其激活不同靶酶活性之间的关系。

研究策略

设计并化学合成由61个寡核苷酸片段连接成的455 bp钙调蛋白基因，设计含多个唯一限制性酶切位点以便定点突变；将基因克隆到pUC8扩增，再构建pKK223-3表达载体，在大肠杆菌中表达，纯化并表征VU-1钙调蛋白，比较其与天然钙调蛋白的酶激活特性。

研究路线图

100%
研究问题：
钙调蛋白甲基化状态
与靶酶激活关系
核心策略：
化学合成含唯一
酶切位点的基因
基因设计：
455 bp 由61个
寡核苷酸拼接
载体构建：
pUC8扩增→pKK223-3
表达载体构建
蛋白表达：
E. coli UT481
tac启动子诱导表达
纯化表征：
VU-1钙调蛋白
确认氨基酸组成序列
酶活比较：
NAD激酶、磷酸二酯酶
激活水平差异显著
关键发现：
甲基化缺失使NAD激酶
最大激活升高3~6倍
结论：
合成基因平台可定点突变
阐明钙调蛋白结构与功能
Text is not SVG - cannot display

下载 .drawio 源文件

核心内容

该研究通过化学合成方法构建了长455 bp的钙调蛋白基因，由61个寡核苷酸片段拼接而成，并在编码序列中设计了27个规律分布的唯一限制性酶切位点以便后续定点突变。合成基因被克隆至pUC8扩增后，转入pKK223-3表达载体，在大肠杆菌中受tac启动子调控表达VU-1钙调蛋白，产量占可溶性蛋白的至少0.4%。纯化后的重组蛋白经氨基酸组成和序列分析确认与设计一致，但缺乏天然钙调蛋白的氨基末端封闭基团和115位三甲基赖氨酸。功能比较显示，VU-1钙调蛋白激活NAD激酶的最大水平分别为菠菜和鸡胗钙调蛋白的3.2倍和6.0倍；在亚饱和条件下达到360 nmol NADP/min/mg蛋白的激活水平，VU-1、衣藻和脊椎动物钙调蛋白所需量分别为0.9、2.6和25 pmol。而激活磷酸二酯酶的半数最大浓度与天然蛋白相当，说明115位赖氨酸的甲基化状态特异影响NAD激酶的最大激活程度，不影响磷酸二酯酶和肌球蛋白轻链激酶。该工作不仅首次在大肠杆菌中获得缺乏翻译后修饰的活性钙调蛋白，还搭建了可系统开展结构-功能研究的定点突变平台。

创新点

合成了自然界不存在的杂交钙调蛋白基因，编码序列含27个唯一且规则分布的限制性酶切位点，便于将来用合成DNA片段进行定点诱变；首次证明大肠杆菌表达的钙调蛋白缺乏N端封闭基团和115位三甲基赖氨酸，并利用该产物揭示115位甲基化状态与NAD激酶最大激活水平相关。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli K12 UT481 钙调蛋白表达系统（tac启动子调控） calmodulin gene (VU-1 calmodulin gene, 455 bp) VU-1 calmodulin 调控 合成的钙调蛋白基因，编码与菠菜/脊椎动物钙调蛋白高度同源的杂交蛋白，缺乏N端封闭和115位三甲基赖氨酸，用于研究钙调蛋白结构与功能
Escherichia coli K12 UT481 钙信号传导 calmodulin gene calmodulin (VU-1, spinach, Chlamydomonas, Dictyostelium, vertebrate) 调控 钙调蛋白作为钙依赖性激活因子，比较不同来源钙调蛋白对NAD激酶和磷酸二酯酶的激活特性
豌豆幼苗（NAD激酶来源） NAD代谢（NAD+磷酸化） — NAD kinase 催化 从豌豆幼苗中部分纯化的NAD激酶，用于检测不同钙调蛋白的激活效果
— 环核苷酸信号 — cyclic nucleotide phosphodiesterase 催化 用于钙调蛋白活性检测的靶酶之一

关键发现

  1. 合成的钙调蛋白基因长455 bp，由61个寡核苷酸拼接而成，含27个唯一限制性酶切位点
  2. 表达产物VU-1钙调蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白的至少0.4%
  3. VU-1钙调蛋白缺乏氨基末端封闭基团和115位三甲基赖氨酸，其氨基酸组成和序列与预期一致
  4. VU-1钙调蛋白激活NAD激酶的最大水平为菠菜钙调蛋白的3.2倍、鸡胗钙调蛋白的6.0倍
  5. 半数最大激活磷酸二酯酶所需的浓度分别为：菠菜/鸡胗钙调蛋白8-14 nM，VU-1钙调蛋白9-18 nM
  6. 在亚饱和浓度下，达到360 nmol NADP/min/mg蛋白的NAD激酶激活水平，所需VU-1、衣藻和脊椎动物钙调蛋白的量分别为0.9、2.6和25 pmol。

研究结论

化学合成的钙调蛋白基因可在E. coli中有效表达，获得缺乏翻译后修饰（N端封闭和115位三甲基赖氨酸）的活性钙调蛋白。对比多种天然钙调蛋白，提示115位赖氨酸未甲基化可能导致NAD激酶激活最大水平升高，而磷酸二酯酶和肌球蛋白轻链激酶激活特性不受影响。该合成基因系统为研究钙调蛋白结构与功能提供了定点突变平台。