Genome Mining in Streptomyces avermitilis: A Biochemical Baeyer-Villiger Reaction and Discovery of a New Branch of the Pentalenolactone Family Tree
- 作者
- Jiaoyang Jiang, Charles N. Tetzlaff, Satoshi Takamatsu, Masato Iwatsuki, Mamoru Komatsu, Haruo Ikeda, David E. Cane
- 单位
- Department of Chemistry, Box H, Brown University, Providence, Rhode Island 02912-9108; Laboratory of Microbial Engineering, Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University, 1-15-1 Kitasato, Sagamihara, Kanagawa 228-8555, Japan
- 杂志
- Biochemistry（2009）
- DOI
- 10.1021/bi900766w
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析Streptomyces avermitilis中pentalenolactone生物合成基因簇中未表征基因ptlE的功能，并发现该途径的新分支。
研究策略
通过基因组挖掘鉴定候选基因簇，在E. coli中异源表达并纯化PtlE，利用体外偶联酶反应鉴定底物和产物；同时构建S. avermitilis基因删除突变株，结合代谢产物分离和X射线晶体学确证产物结构。
核心内容
该研究通过基因组挖掘解析了Streptomyces avermitilis中pentalenolactone生物合成基因簇中未表征基因ptlE的功能。研究者将ptlE在大肠杆菌中异源表达并纯化PtlE蛋白，利用体外偶联酶反应鉴定其底物与产物，同时构建系列基因删除突变株并结合代谢产物分离和X射线晶体学确证产物结构。结果表明，PtlE是FAD依赖的Baeyer-Villiger单加氧酶，在NADPH存在下催化1-脱氧-11-氧代pentalenic acid的Baeyer-Villiger氧化，但反应区位选择性不同于预期，生成新化合物neopentalenolactone D。ΔptlD突变株积累该新产物，ΔptlE突变株积累底物及氧化副产物，双突变株则主要积累底物，证实了PtlE在该分支中的关键作用。产物甲酯经X射线晶体学确证结构，工程菌中检测到氧化内酯及开环酸产物。该发现揭示了pentalenolactone家族的一个新生物合成分支，拓展了对该类天然产物结构多样性和生物合成机制的认识。
创新点
首次发现PtlE催化的Baeyer-Villiger反应具有与预期相反的区位选择性，产生新的pentalenolactone家族成员neopentalenolactone D，揭示了新的生物合成分支。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | pentalenolactone生物合成（neopentalenolactone分支） | ptlE | PtlE | 催化 | FAD依赖Baeyer-Villiger单加氧酶，催化1-脱氧-11-氧代pentalenic acid (12)氧化为neopentalenolactone D (13) |
| Escherichia coli BL21(DE3) | pentalenolactone生物合成（neopentalenolactone分支） | ptlF | PtlF | 催化 | NAD+依赖短链脱氢酶/还原酶，催化1-脱氧-11β-羟基pentalenic acid (11)氧化为12 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | pentalenolactone生物合成（neopentalenolactone分支） | ptlH | PtlH | 催化 | 非血红素铁/α-酮戊二酸依赖双加氧酶，催化1-脱氧pentalenic acid (4)羟基化生成11 |
| Streptomyces avermitilis (SUKA16/SUKA5) | pentalenolactone生物合成（neopentalenolactone分支） | ptlD | PtlD | 催化 | 推测为α-酮戊二酸依赖双加氧酶，负责neopentalenolactone D (13)的进一步氧化 |
| Streptomyces avermitilis | pentalenolactone生物合成（neopentalenolactone分支） | ptlA | PtlA | 催化 | pentalenene合酶，催化法尼基二磷酸环化生成pentalenene |
| Streptomyces avermitilis | pentalenolactone生物合成（neopentalenolactone分支） | ptlI | PtlI | 催化 | 细胞色素P450，催化pentalenene (2)两步氧化为1-脱氧pentalenol (9)和1-脱氧pentalenol (10) |
关键发现
体外实验表明，重组PtlE在NADPH和FAD存在下催化1-脱氧-11-氧代pentalenic acid (12)的Baeyer-Villiger氧化，生成新化合物neopentalenolactone D (13)（m/z 278，GC保留时间13.81 min，与pentalenolactone D甲酯5-Me的13.70 min不同）。ΔptlD突变株积累13，ΔptlE突变株积累12及氧化副产物14和15，ΔptlEΔptlD双突变株主要积累12。13-甲酯经X射线晶体学确证（空间群P21 21 21，a=10.068(3) Å, b=24.219(3) Å, c=6.109(4) Å, V=1489(1) Å^3）。工程菌SUKA5和pKU462::ermRp-ptl cluster产生氧化内酯18（3.79 mg）及开环酸16和17。PtlE蛋白SDS-PAGE显示64 kDa，但含GroEL伴侶蛋白。
研究结论
PtlE是FAD依赖的Baeyer-Villiger单加氧酶，催化12氧化为neopentalenolactone D，这是pentalenolactone家族的一个新分支；PtlD可能进一步催化13形成neopentalenolactone F，最终产生18等产物。