A Chimeric Inorganic Pyrophosphatase Derived from Escherichia coli and Thermus thermophilus Has an Increased Thermostability
- 作者
- Takanori Satoh, Yoshimasa Takahashi, Noriko Oshida, Atsushi Shimizu, Hiroshi Shinoda, Machiko Watanabe, Tatsuya Samejima
- 单位
- Department of Chemistry, College of Science and Engineering, Aoyama Gakuin University, 6-16-1 Chitosedai Setagaya-ku, Tokyo, Japan
- 杂志
- Biochemistry（1999）
- DOI
- 10.1021/bi981445r
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
探索决定无机焦磷酸酶热稳定性的关键因素，并通过随机嵌合酶法构建具有增强热稳定性的嵌合酶。
研究策略
利用随机嵌合酶法，将大肠杆菌和嗜热栖热菌的PPase基因重组，筛选获得两个嵌合体T1-135E和T1-149E，纯化后比较其活性、热稳定性和构象变化。
核心内容
本研究利用随机嵌合酶法，将大肠杆菌和嗜热栖热菌的无机焦磷酸酶基因进行重组，筛选获得两个嵌合体T1-135E和T1-149E，并纯化后比较其活性、热稳定性及构象变化。结果显示，Tth PPase在37°C的比活性为498 units/mg，大肠杆菌PPase为1210 units/mg，而T1-135E和T1-149E分别为278和668 units/mg。两种嵌合酶最适温度均为75°C，其中T1-135E在该温度下比活性高达7920 units/mg，T1-149E为5530 units/mg。T1-135E在50–80°C加热后出现热激活，90°C加热1小时仍保留40%活性，且在0.05% SDS存在下稳定性依然高于其他酶；5% SDS中其荧光光谱构象稳定，而其余酶在40–50°C即发生红移。通过序列比对，鉴定出四个关键残基（Thr138/Ala141与His138/Asp141，以及Ala144-Lys145缺失）位于三聚体-三聚体界面附近，通过影响亚基相互作用和结构完整性提升热稳定性。该研究为设计更稳定的酶提供了可行策略。
创新点
发现T1-135E比亲本Tth PPase更稳定，并鉴定出四个关键残基（Thr138/Ala141与His138/Asp141，以及Ala144-Lys145缺失）对热稳定性的贡献。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 无机焦磷酸水解 | Tth ppa | Thermus thermophilus无机焦磷酸酶 | 催化 | 野生型亲本，最适温度75°C，37°C比活性498 units/mg |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 无机焦磷酸水解 | E. coli ppa | Escherichia coli无机焦磷酸酶 | 催化 | 野生型亲本，最适温度55°C，37°C比活性1210 units/mg |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 无机焦磷酸水解 | 嵌合体T1-135E (Tth残基1-135 + E. coli残基136-173) | 嵌合无机焦磷酸酶T1-135E | 催化 | 热稳定性显著高于Tth PPase，90°C保留40%活性，最适温度75°C时比活性7920 units/mg |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 无机焦磷酸水解 | 嵌合体T1-149E (Tth残基1-149 + E. coli残基150-175) | 嵌合无机焦磷酸酶T1-149E | 催化 | 热稳定性与Tth PPase相当，最适温度75°C时比活性5530 units/mg |
关键发现
- Tth PPase在37°C的比活性为498 units/mg，E. coli PPase为1210 units/mg
- T1-135E为278 units/mg，T1-149E为668 units/mg。两种嵌合酶的最适温度均为75°C，T1-135E在该温度下比活性为7920 units/mg，T1-149E为5530 units/mg。T1-135E在50-80°C加热后出现热激活，90°C加热1h后仍保留40%活性
- T1-149E加热至80°C仍有活性，但90°C后基本失活。在0.05% SDS存在下，T1-135E热稳定性仍高于其他酶，在5% SDS中荧光光谱显示其构象稳定，而其他酶在40-50°C即发生红移。T1-135E加热后荧光蓝移2 nm，T1-149E在80°C以上红移3 nm。
研究结论
通过随机嵌合酶法成功获得热稳定性增强的嵌合PPase，其中T1-135E的四个关键残基位于三聚体-三聚体界面附近，通过影响亚基相互作用和结构完整性提高热稳定性，为设计更稳定的酶提供了策略。