Enzymatic Cyclization of (R,S)-14,15-Oxidogeranylgeranyl Pyrophosphate to 3α- and 3β-Hydroxykaurene
- 作者
- R. M. Coates, R. A. Conradi, D. A. Ley, A. Akeson, J. Harada, S.-C. Lee, C. A. West
- 单位
- Department of Chemistry, University of Illinois, Urbana, Illinois 61801; Department of Chemistry, University of California, Los Angeles, California 90024
- 杂志
- Journal of the American Chemical Society（1976）
- DOI
- 10.1021/ja00431a060
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究环氧类似物14,15-氧化香叶基香叶基焦磷酸（4-OPP）能否被二萜环化酶（kaurene synthetase）环化为带有C3羟基的贝壳杉烯，从而探索环氧底物作为替代底物以及C3羟基直接由环化引入的可能性。
研究策略
化学合成放射性标记的(R,S)-14,15-环氧香叶基香叶基焦磷酸，利用Echinocystis macrocarpa等来源的可溶性酶制剂进行酶促反应，通过TLC、HPLC、GC/MS、NMR及酶动力学分析鉴定产物，并进行对照实验验证。
研究路线图
创新点
首次证明环氧焦磷酸类似物可作为二萜环化酶的底物，生成3α-和3β-羟基贝壳杉烯；观察到C3羟基可由环化直接引入而非后氧化；3β-羟基异构体的形成支持了轴向羟基萜类可能通过环氧化物前体直接环化产生的假说。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Echinocystis macrocarpa 胚乳匀浆 | 赤霉素生物合成途径（二萜环化） | — | kaurene synthetase | 催化 | 催化4-OPP环化为3α-和3β-羟基贝壳杉烯，Km约为9 μM |
| Echinocystis macrocarpa 胚乳匀浆 | 贝壳杉烯氧化途径 | — | 微体氧化酶 | 催化 | 氧化3α-羟基贝壳杉烯为未知代谢物，Km约0.5 μM |
| Ricinus communis 幼苗 | 二萜生物合成途径 | — | 二萜环化酶 | 催化 | 将4-OPP转化为多种羟基二萜，至少三种具有3-羟基二萜的TLC迁移率 |
| Fusarium moniliforme 菌丝体 | 赤霉素生物合成途径 | — | 二萜环化酶 | 催化 | 将4-OPP转化为与5和6迁移率相同的产物 |
关键发现
- 4-OPP被E. macrocarpa酶制剂转化为两种产物：3α-羟基贝壳杉烯（23%放射性产率，约260 μg）和3β-羟基贝壳杉烯（5%放射性产率，约60 μg），3α-羟基贝壳杉烯基于单对映体产率为46%
- 4-OPP环化的Km约为9 μM，而正常底物1-OPP的Km为1.5 μM，且1-OPP为竞争性抑制剂（Ki≈Km），表明同一酶催化
- 微体氧化酶对kaurene和3α-羟基贝壳杉烯的表观Km均约为0.5 μM
- R. communis和F. moniliforme的酶制剂也能将4-OPP转化为类似产物。
研究结论
环氧类似物4-OPP可被多种来源的二萜环化酶接受并转化为3-羟基贝壳杉烯，表明二萜环化酶对额外官能团具有显著耐受性，并提供了一条可能的替代生物合成途径（1-OPP→4-OPP→5和/或6）；3β-羟基产物的形成支持了轴向羟基萜类可能通过直接环化环氧前体生成的假说。