Aristolochene Synthase: Mechanistic Analysis of Active Site Residues by Site-Directed Mutagenesis
- 作者
- Brunella Felicetti, David E. Cane
- 单位
- Department of Chemistry, Box H, Brown University, Providence, Rhode Island 02912-9108
- 杂志
- Journal of the American Chemical Society（2004）
- DOI
- 10.1021/ja0499593
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析双功能倍半萜合酶aristolochene synthase活性位点残基的催化功能，验证环化机制中关键中间体(S)-germacrene A的形成，并明确Tyr-92是否为质子化中间体的活性位点Lewis酸。
研究策略
对Penicillium roqueforti和Aspergillus terreus来源的aristolochene synthase进行定点突变，在大肠杆菌中异源表达并纯化突变蛋白，测定稳态动力学参数（kcat、Km、kcat/Km），通过GC-MS分析产物组成及立体化学，系统比较突变对催化效率和产物分配的影响。
核心内容
该研究通过定点突变解析了双功能倍半萜合酶aristolochene synthase活性位点残基的催化功能。研究对Penicillium roqueforti和Aspergillus terreus来源的酶进行系统突变，在大肠杆菌中异源表达并纯化突变蛋白，测定稳态动力学参数，并通过GC-MS分析产物组成。研究者首次直接检测到野生型P. roqueforti酶催化FPP环化时释放的中间体(S)-(-)-germacrene A占4%，而构建的E252Q突变体使产物几乎100%为germacrene A，为germacrene A是催化中间体提供了直接证据。Y92F突变体仍能产生81% aristolochene且kcat/Km仅降低2倍，明确排除了Tyr-92作为活性位点Lewis酸的可能性。N244D突变体kcat降低350倍，产物中germacrene A比例升至81%。两个保守Mg2+结合域残基对底物结合、离子化和后续环化至关重要，突变导致活性显著降低及中间体过早释放。该研究不仅证实了germacrene A是环化过程的关键中间体，还排除了Tyr-92的Lewis酸功能，为理解倍半萜合酶的催化机制提供了重要依据，但负责质子化germacrene A的活性位点酸的身份仍有待确认。
创新点
['首次直接检测到野生型P. roqueforti aristolochene synthase催化FPP环化时释放的中间体(S)-(-)-germacrene A（占比4%）', '构建E252Q突变体使产物几乎100%为germacrene A，为germacrene A是催化中间体提供了直接证据', '通过Y92F突变体仍能产生81% aristolochene的事实，明确排除了Tyr-92作为活性位点Lewis酸的可能性', '系统研究了两个保守Mg2+结合域各残基突变对产物分布的影响，揭示了N244D、S248A、E252D等突变使germacrene A比例升至80%以上']
研究对象（19）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase (wild-type) | 催化 | 催化FPP环化生成(+)-aristolochene，伴生产物germacrene A和valencene |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase D115E | 催化 | 天冬氨酸富集域突变体，kcat降低约3倍，germacrene A比例升至19% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase D115N | 催化 | 完全失活，表明Asp-115为关键催化残基 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase D116E | 催化 | kcat降低30倍，germacrene A比例升至35% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase D116N | 催化 | kcat降低约20倍，产物分布与D116E相似 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase E119D | 催化 | 动力学参数和产物分布与野生型几乎相同 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase E119Q | 催化 | germacrene A比例升至14%，kcat/Km略有下降 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase N244D | 催化 | kcat降低350倍，kcat/Km约2000倍降低，产物81%为germacrene A |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase N244L | 催化 | 完全失活，表明Asn-244为关键残基 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase S248A | 催化 | kcat约30倍降低，产物79%为germacrene A |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase E252D | 催化 | kcat约30倍降低，产物81%为germacrene A |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase E252Q | 催化 | 产物几乎100%为germacrene A，kcat/Km约3500倍降低 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase S248A/E252D | 催化 | 双突变体完全失活 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P. roqueforti aristolochene synthase gene (pZW04) | P. roqueforti aristolochene synthase Y92F | 催化 | kcat降低100倍但Km降低50倍，产物81%为aristolochene，排除Tyr-92作为Lewis酸 |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 倍半萜生物合成 | A. terreus aristolochene synthase gene (pET11rASA) | A. terreus aristolochene synthase (wild-type) | 催化 | 仅产生(+)-aristolochene，无副产物 |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 倍半萜生物合成 | A. terreus aristolochene synthase gene (pET11rASA) | A. terreus aristolochene synthase AT-N219D | 催化 | kcat约200倍降低，kcat/Km约6600倍降低，产物56:44为germacrene A:aristolochene |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 倍半萜生物合成 | A. terreus aristolochene synthase gene (pET11rASA) | A. terreus aristolochene synthase AT-E227D | 催化 | 产物74%为germacrene A |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 倍半萜生物合成 | A. terreus aristolochene synthase gene (pET11rASA) | A. terreus aristolochene synthase AT-E227Q | 催化 | 完全失活 |
| Escherichia coli (重组表达宿主) | 倍半萜生物合成 | pentalenene synthase W308F mutant | pentalenene synthase W308F | 催化 | 用于制备标准品(R)-(+)-germacrene A |
关键发现
- 野生型P. roqueforti aristolochene synthase将FPP转化为94% (+)-aristolochene、4% (S)-(-)-germacrene A和2% (-)-valencene
- A. terreus酶仅产生(+)-aristolochene。Y92F突变体kcat降低100倍（从43×10^-3 s^-1降至0.40×10^-3 s^-1），Km降低50倍（从0.6 μM降至0.012 μM），催化效率kcat/Km仅降低2倍（3.4×10^4 vs 7.2×10^4 s^-1 M^-1），产物中aristolochene占81%、valencene 7%、germacrene A 12%。E252Q突变体kcat/Km降至21.8 s^-1 M^-1（约3500倍降低），产物几乎100%为germacrene A（<0.1% aristolochene）。N244D突变体kcat降低350倍，Km升高6倍，kcat/Km降至36.4 s^-1 M^-1（约2000倍降低），产物81%为germacrene A。A. terreus的AT-N219D突变体kcat/Km降低约6600倍，产物中germacrene A:aristolochene为56:44。D115N、N244L、S248A/E252D双突变体及A. terreus E227Q突变体完全失活。
研究结论
定点突变实验证实(S)-(-)-germacrene A是P. roqueforti和A. terreus aristolochene synthase催化FPP环化生成(+)-aristolochene过程中的关键中间体；两个保守Mg2+结合域残基对底物结合、离子化和后续环化至关重要，突变导致活性降低及中间体过早释放；Tyr-92不是负责质子化germacrene A的活性位点Lewis酸，该酸的身份仍有待进一步研究。