Bifunctional Triterpene/Sesquaterpene Cyclase: Tetraprenyl-β-curcumene Cyclase Is Also Squalene Cyclase in Bacillus megaterium
- 作者
- Tsutomu Sato, Hiroko Hoshino, Satoru Yoshida, Mami Nakajima, Tsutomu Hoshino
- 单位
- Department of Applied Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, and Graduate School of Science and Technology, Niigata University; Center for Instrumental Analysis, Niigata University
- 杂志
- Journal of the American Chemical Society（2011）
- DOI
- 10.1021/ja2060319
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
发现并证明Bacillus megaterium中的tetraprenyl-β-curcumene环化酶(TC)具有双功能，不仅能催化C35的tetraprenyl-β-curcumene环化生成五环sesquaterpene，还能催化C30的鲨烯环化生成双环三萜，这是首次报道体内双功能萜烯环化酶。
研究策略
利用重组纯化的枯草芽孢杆菌TC与B. megaterium TC分别对底物1和8进行体外酶活检测，通过GC-MS和NMR鉴定产物结构；在B. megaterium中检测天然产物8和11；并在同一反应体系中混合底物验证双功能。
核心内容
该研究首次发现并证明巨大芽孢杆菌中的tetraprenyl-β-curcumene环化酶（TC）具有双功能催化活性，既能催化C35底物tetraprenyl-β-curcumene环化生成五环sesquiterpene，又能催化C30底物鲨烯环化生成双环三萜产物11（8α-hydroxypolypoda-13,17,21-triene）。通过重组纯化酶体外活性检测、GC-MS和NMR结构鉴定，以及体内产物检测，作者证实BMD_2134基因编码的TC在巨大芽孢杆菌中同时参与两条萜烯生物合成途径。从20 mg鲨烯反应中纯化得到3.7 mg产物11，混合底物条件下两种环化产物均可生成。该研究还发现枯草芽孢杆菌的TC不能产生11，且pH变化不影响产物选择性。这是自然界首次报道双功能萜烯环化酶，为理解萜烯环化酶的底物识别机制和进化关系提供了新视角。
创新点
['首次发现并证明一种萜烯环化酶在体内同时催化不同碳数(C35和C30)的两种环化反应', '鉴定出8α-hydroxypolypoda-13,17,21-triene (11)是B. megaterium的天然三萜产物', '揭示了TC与SHC底物选择性的差异及其可能的机制']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus megaterium | 三萜/倍半萜烯生物合成 | tc (BMD_2134) | tetraprenyl-β-curcumene cyclase (TC) | 催化 | 双功能酶，催化tetraprenyl-β-curcumene(1)环化为3，以及鲨烯(8)环化为11 |
| Bacillus subtilis | C35 sesquaterpene生物合成 | tc (BSU19320) | tetraprenyl-β-curcumene cyclase (TC) | 催化 | 可催化1生成3，但不能催化8，体内不产生11 |
| Alicyclobacillus acidocaldarius | 三萜生物合成 | shc | squalene-hopene cyclase (SHC) | 催化 | 催化8生成hopene(9)和hopanol(10)，不能催化1 |
| Bacillus megaterium | 鲨烯生物合成 | BMD_0659, BMD_3864 | squalene synthase/phytoene synthase homologues | 催化 | 推测负责尾-尾缩合生成鲨烯(8)，为TC提供底物 |
关键发现
- B. megaterium TC (BMD_2134) 同时催化tetraprenyl-β-curcumene(1)生成3和鲨烯(8)生成11
- 从20 mg鲨烯反应中纯化得到3.7 mg 11
- 混合底物40μM 1和160μM 8时，两种产物3和11均被检测到
- B. megaterium孢子培养基中检测到8和11，其他五种Bacillus仅产生sesquaterpenes
- pH变化不影响TC的产物选择性
- 枯草芽孢杆菌TC在体内不能产生11。
研究结论
B. megaterium的tetraprenyl-β-curcumene环化酶是双功能萜烯环化酶，既参与C35 sesquaterpene生物合成又参与C30三萜生物合成，这是自然界中首次报道此类双功能环化酶，为理解萜烯环化酶催化机制和进化提供了新视角。