Heterologous production of ascofuranone and ilicicolin A in Aspergillus sojae
- 作者
- Yasuko Araki, Yasutomo Shinohara, Seiichi Hara, Atsushi Sato, Ryoichi Sakaue, Keiko Gomi, Kiyoshi Kita, Kotaro Ito
- 单位
- Research and Development Division, Kikkoman Corporation; School of Tropical Medicine and Global Health, Nagasaki University; Department of Host-Defense Biochemistry, Institute of Tropical Medicine, Nagasaki University
- 杂志
- Journal of General and Applied Microbiology（2022）
- DOI
- 10.2323/jgam.2021.08.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Acremonium egyptiacum 产生 ascofuranone 时伴生有害的 ascochlorin，其抑制哺乳动物线粒体复合物III，制约工业化生产；需要寻找安全宿主实现 ascofuranone 和其前体 ilicicolin A 的异源生产。
研究策略
在 Aspergillus sojae 中异源表达 ascofuranone 生物合成基因 (ascA-E, H-J)，通过添加氯离子满足卤化酶 AscD 活性，并利用多拷贝整合系统增强限速酶表达以提高产量。
核心内容
为规避原始宿主Acremonium egyptiacum生产ascofuranone时伴生有害副产物ascochlorin的问题，该研究在食品安全级宿主Aspergillus sojae中异源表达了ascofuranone生物合成基因簇（ascA-E、H-J）。研究表明，卤化酶AscD的活性严格依赖氯离子，在添加5% NaCl时，基础菌株As-CABD产ilicicolin A达8 mg/L。通过多拷贝整合策略增强限速酶表达，携带46拷贝ascD的菌株在无NaCl条件下产量提升至26 mg/L，而同时提高ascB与ascD拷贝数的As-mcCABD菌株（18拷贝ascB、22拷贝ascD）产量达约100 mg/L，较基础菌株提高10倍以上。进一步整合完整基因簇后成功检测到ascofuranone（约0.3 mg/L），但产量仍低，推测受限于AscH活性不足或宿主内源水解酶干扰。该研究首次在A. sojae中实现ascofuranone及其前体的异源合成，验证了氯离子补充与多拷贝整合的关键作用，为安全高效生产该类药物先导化合物奠定了基础，但仍需优化P450还原系统以提升终产物产量。
创新点
首次在 A. sojae 中实现 ascofuranone 及 ilicicolin A 的异源生物合成；明确了氯离子对 AscD 卤化反应的必要性；采用多拷贝整合策略使 ilicicolin A 产量提高10倍以上；发现 AscD 过表达与 AscB 竞争底物导致需同时增加 ascB 拷贝。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus sojae | ascofuranone/ilicicolin A 生物合成途径 | ascA | AscA | 催化 | 异戊烯基转移酶，参与聚酮-萜杂合前体 ilicicolinic acid B 的合成 |
| Aspergillus sojae | ascofuranone/ilicicolin A 生物合成途径 | ascB | AscB | 催化 | NRPS-like 还原酶，参与 ilicicolin A 前体转化 |
| Aspergillus sojae | ascofuranone/ilicicolin A 生物合成途径 | ascC | AscC | 催化 | 聚酮合酶 (PKS)，催化聚酮链合成 |
| Aspergillus sojae | ascofuranone/ilicicolin A 生物合成途径 | ascD | AscD | 催化 | 卤化酶，需要氯离子作为底物，是 ilicicolin A 合成限速酶 |
| Aspergillus sojae | ascofuranone/ilicicolin A 生物合成途径 | ascE | AscE | 催化 | P450 单加氧酶，催化环氧化反应 |
| Aspergillus sojae | ascofuranone/ilicicolin A 生物合成途径 | ascH | AscH | 催化 | P450 单加氧酶，催化后续氧化反应，需 Cpr 电子供体 |
| Aspergillus sojae | ascofuranone/ilicicolin A 生物合成途径 | ascI | AscI | 催化 | 萜烯环化酶，催化环化反应 |
| Aspergillus sojae | ascofuranone/ilicicolin A 生物合成途径 | ascJ | AscJ | 催化 | 脱氢酶，催化最后氧化步骤生成 ascofuranone |
| Aspergillus sojae | ascofuranone/ilicicolin A 生物合成途径 | cprA | CprA | 能量供给 | 来自 A. sojae 的细胞色素 P450 还原酶，为 AscH 提供电子 |
关键发现
- 添加5% NaCl 时，As-CABD 菌株产 ilicicolin A 达 8 mg/L；添加0.1%以上NaCl即可检测到。As-CAB_mcD 菌株（46拷贝 ascD）在无 NaCl 条件下产 ilicicolin A 26 mg/L。As-mcCABD 菌株（18拷贝 ascB，22拷贝 ascD）产量约100 mg/L，较 As-CABD 提高10倍以上
- 5% NaCl时产量从85±11增至110±27 mg/L。10% NaCl抑制产量，并积累 ilicicolinic acid A (m/z
- 。最终整合 ascCABDEHIJ 的菌株产 ascofuranone 约0.3 mg/L，通过LC-MS确认（[M-H] 419）。As-CABDE 中产生 m/z 389 的旁路产物（推测水解产物）。
研究结论
在安全的 A. sojae 宿主中成功异源合成了 ascofuranone 及其前体 ilicicolin A。通过添加氯离子和多拷贝增强 ascD/ascB 表达可显著提高 ilicicolin A 产量；但 ascofuranone 产量仍低，可能受 AscH 活性不足或内源水解酶影响，需进一步优化P450还原系统或工程改造宿主。