高级醇 · 代谢工程文献库

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A Pressure Test to Make 10 Molecules in 90 Days: External Evaluation of Methods to Engineer Biology

作者
Arturo Casini, Fang-Yuan Chang, Raissa Eluere, Andrew M. King, Eric M. Young, Quentin M. Dudley, Ashty Karim, Katelin Pratt, Cassandra Bristol, Anthony Forget, Amar Ghodasara, Robert Warden-Rothman, Rui Gan, Alexander Cristofaro, Amin Espah Borujeni, Min-Hyung Ryu, Jian Li, Yong-Chan Kwon, He Wang, Evangelos Tatsis, Carlos Rodriguez-Lopez, Sarah O'Connor, Marnix H. Medema, Michael A. Fischbach, Michael C. Jewett, Christopher Voigt, D. Benjamin Gordon
单位
The Foundry; Broad Institute of MIT and Harvard; Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology; Department of Chemical and Biological Engineering, Center for Synthetic Biology, Northwestern University; Department of Biological Chemistry, John Innes Centre; Bioinformatics Group, Wageningen University; Department of Bioengineering and Chemistry, Engineering & Medicine for Human Health, Stanford University
杂志
Journal of the American Chemical Society（2017）
DOI
10.1021/jacs.7b13292
所属领域
代谢工程 / 合成生物学
关键词
biofoundriescell-free systemsenzyme miningmetabolic engineeringnatural productspressure testretrosynthetic designsynthetic biology
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解决的核心问题

评估一个集中式基因工程设施（生物铸造厂）在仅90天的限定时间内，针对事先未知的10种目标小分子构建生产生物体的能力，并识别现有技术在快速响应紧急需求时的瓶颈。

研究策略

针对不同目标分子并行采用多种方法：酶挖掘与表达平衡（1-十六醇、长春新碱）、逆合成设计（后马托品、雷贝卡霉素）、消除天然调控（吡咯菌素、巴酰胺、帕西达霉素D）、识别新型天然生产者（C-1027）、以及无细胞系统（香芹酮、四氢呋喃）。同时利用计算机辅助设计、自动化组装和高通量筛选。

研究路线图

100%
研究问题：90天限时评估生物铸造厂对10个未知目标分子的生产能力
策略：并行采用五种工程策略（酶挖掘、逆合成、调控解除、天然生产者、无细胞系统）
关键改造：多种酶重构与调控优化（FAR、prnABCD、pac1等）
结果：6/10目标达成，产量提升（1-十六醇238 mg/L等）
结论：生物铸造厂具备应急生产潜力，基因合成等为主要瓶颈
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核心内容

该研究对一家集中式基因工程设施进行了为期90天的限时压力测试，要求针对事先未知的10种目标小分子构建生产生物体。团队并行采用酶挖掘与表达平衡、逆合成设计、消除天然调控、识别新型天然生产者及无细胞系统等多种策略，并辅以计算机辅助设计、自动化组装和高通量筛选。结果显示，在10个目标中有6个实现了目标分子或密切相关分子的生产：1-十六醇在酿酒酵母中最高产量达238 mg/L，新挖掘的海龟脂肪酰-CoA还原酶达204 mg/L；吡咯菌素经在E. coli中重构并敲除trpR后产量从3.6 mg/L提升至11 mg/L；帕西达霉素D在S. albidoflavus J1074中丰度是原始生产菌的13倍；雷贝卡霉素糖苷配基产量约0.7 mg/L；无细胞系统合成柠檬烯中间体达23 mg/L；C-1027生色团在新型天然菌株中产量约为原先的20倍。研究还构建了覆盖540种双吲哚产物空间的7802个条形码化转录单元DNA池。该工作表明现代合成生物学工具能在紧迫时限内实现多种产物的快速生产，但基因合成时间、菌株获得、化合物毒性和天然调控仍是主要瓶颈，为生物铸造厂应对紧急化学品需求提供了能力评估和改进方向。

创新点

首次对生物铸造厂进行限时压力测试；在90天内完成6/10目标分子的生产或相关分子生产；发现新的脂肪酰-CoA还原酶和新型C-1027天然生产菌株；实现了吡咯菌素基因簇在E. coli中的重构和产量提升；构建了7802个可检索的条形码化转录单元DNA池，覆盖540种双吲哚产物空间；建立了从甲羟戊酸到柠檬烯的无细胞生产系统。

研究对象（10）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae 脂肪酸代谢（1-十六醇生物合成） FAR (TaFAR from barn owl, CmFAR from sea turtle), EutE (ACDH), ACC1, ACL1, ACL2, RPD3 脂肪酰-CoA还原酶（FAR）; 乙酰化乙醛脱氢酶（EutE/ACDH） 催化 FAR催化脂肪酰-CoA还原为脂肪醇；ACDH将乙醛转化为乙酰-CoA，补充前体；RPD3缺失用于增加前体供应。在ΔRPD3背景下，TaFAR+ACDH产量238 mg/L，CmFAR+ACDH产量204 mg/L。
Saccharomyces cerevisiae 单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成（长春新碱途径补充） geissoschizine synthase (ADH), geissoschizine oxidase (P450), 9个还原酶候选基因 乙醇脱氢酶; 细胞色素P450; 还原酶 催化 用于桥接strictosidine到tabersonine/catharanthine的酶缺口。构建74株菌，1.5 Mb DNA，检测到akuamine中间体(m/z=325)及m/z=489未鉴定产物。
Escherichia coli 吡咯菌素生物合成 prnABCD (codon-optimized), T7 RNAP, trpR (敲除) PrnA, PrnB, PrnC, PrnD; T7 RNA聚合酶; TrpR阻遏蛋白 催化 将来自Pseudomonas chlororaphis的四个基因重构为独立转录单元，通过IPTG诱导T7RNAP控制表达。ΔtrpR敲除后产量达11 mg/L。
Escherichia coli 双吲哚生物合成（雷贝卡霉素苷元） rebC, rebD, rebF, rebH, rebO, rebP, rebT; 以及21个修饰基因（如abeX2, abeM1, espX1, marM） RebC, RebD, RebF, RebH, RebO, RebP, RebT（催化双吲哚骨架合成及氯化）; 修饰酶（甲基化、糖基化等） 催化 构建E. coli菌株生产rebeccamycin aglycon，产量约0.7 mg/L。DNA池包含7802个条形码转录单元，可组装成最多4基因的修饰途径，覆盖540种双吲哚产物。
Escherichia coli (cell-free lysate) 甲羟戊酸途径至柠檬烯（香芹酮前体） 甲羟戊酸途径基因（来自S. cerevisiae, E. coli）, 柠檬烯合酶（来自Abies grandis或Mentha spicata） 柠檬烯合酶 催化 无细胞系统在添加15 mM甲羟戊酸后产生23 mg/L柠檬烯（12小时），但未能进一步转化为香芹酮。
Streptomyces albidoflavus J1074; Streptomyces coelicolor M1146; Streptomyces albovinaceus ATCC 33021 帕西达霉素D生物合成基因簇 pac1（编码激活因子）, ssaA同源基因; 受P_ermE*启动子控制 Pac1 (SsaA-like activator) 调控 将pac1置于组成型启动子P_ermE*下后，在所有测试链霉菌中实现帕西达霉素D生产，S. albidoflavus J1074中丰度为原始菌株的13倍。
Escherichia coli 巴酰胺生物合成基因簇 barABCD, barEF, barGH, barKJI（插入T7启动子） BarA, BarB, BarC, BarD, BarE, BarF, BarG, BarH, BarK, BarJ, BarI 催化 26 kb基因簇克隆至穿梭载体，但转入表达菌株后发生重组导致barEFGH缺失，未检测到产物。
Streptomyces albovinaceus ATCC 33021; Streptomyces globisporus ATCC 19906; 异源表达于S. albidoflavus J1074, S. coelicolor M1146, E. coli C-1027烯二炔抗生素生物合成 C-1027基因簇（76 kb, 56个基因）; 3-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶等 C-1027生色团生物合成酶类 催化 通过BLAST搜索发现并确认两个新天然生产者。S. albovinaceus ATCC 33021产生C-1027生色团2 mg/L，约为S. globisporus ATCC 19906的20倍。异源转移未检测到完整产物，但在S. albidoflavus中检测到中间体3-烯醇丙酮酰邻氨基苯甲酸。
Saccharomyces cerevisiae (设计路径) 逆合成设计的表聚乳酸（Epicolactone）生物合成路径 候选酶：PK-NRP合成酶, P450, 黄素依赖性还原酶, 非血红素铁双加氧酶, 黄素单加氧酶, 漆酶 P450单加氧酶; 漆酶; PK-NRP合成酶; 黄素依赖性还原酶; 双加氧酶 催化 因无法获得生产菌基因组，基于8步化学合成设计酶法路径。未能在期限内完成构建和测试。
Escherichia coli (cell-free lysate) 四氢呋喃（THF）新设计路径（基于盐孢菌素A途径） salinosporamide-A途径的7个酶基因; 羧酸还原酶基因 4-氯-巴豆酰-CoA合成相关酶; 羧酸还原酶（CAR） 催化 验证了所有酶在无细胞系统中的表达，但未检测到THF产物。先前实验确认THF/DHF对系统有毒性（在5%浓度下抑制GFP）。

关键发现

  1. 在10个目标中，6个实现了目标分子或密切相关分子的生产。1-十六醇在S. cerevisiae中最高产量达238 mg/L（对照菌株为160 mg/L），新挖掘的sea turtle FAR达204 mg/L
  2. 吡咯菌素在E. coli中经重构和消除trpR抑制后产量达11 mg/L（初始3.6 mg/L，优化后4.8 mg/L）
  3. 帕西达霉素D在S. albidoflavus J1074中产量为10-50 mg/L，且丰度是原始生产菌的13倍
  4. 雷贝卡霉素糖苷配基在E. coli中产量约0.7 mg/L
  5. 无细胞系统生产柠檬烯中间体达23 mg/L（12小时）
  6. C-1027生色团在S. albovinaceus ATCC 33021中产量约2 mg/L，是S. globisporus ATCC 19906的约20倍
  7. 长春新碱途径补充中检测到akuamine中间体（m/z=325）及未鉴定产物（m/z=489）。总计构建1.2 Mb DNA、215株菌（涉及5个物种）、2个无细胞系统、690种自行开发的检测方法。预测的540种双吲哚产物中98%未在PubChem中注释。

研究结论

研究表明，现代合成生物学工具能够在紧迫时间限制下实现多种天然和非天然产物的快速生产，但基因合成时间、菌株获得、化合物毒性、分析方法和天然调控等因素仍是主要瓶颈。通过多种工程策略的组合，生物铸造厂展现出应对紧急化学品需求的潜力，同时为未来技术改进指明了方向。