Enhanced delignification of lignocellulosic substrates by Pichia GS115 expressed recombinant laccase
- 作者
- Vidya Pradeep Kumar, Atul P. Kolte, Arindam Dhali, Chandrashekar Naik, Manpal Sridhar
- 单位
- National Institute of Animal Nutrition and Physiology, Adugodi, Bangalore, Karnataka, India; Sir M. Visvesvaraya Institute of Technology, Bangalore, Karnataka, India
- 杂志
- The Journal of General and Applied Microbiology（2017）
- DOI
- 10.2323/jgam.2017.11.006
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
野生型漆酶产量低，限制了其在木质纤维素降解和反刍动物饲料预处理中的工业应用。
研究策略
对裂褶菌（Schizophyllum commune）漆酶基因进行密码子优化，合成后克隆至pPIC9K载体，电转化毕赤酵母GS115（his4），筛选高拷贝转化子，在甲醇诱导下分泌表达重组漆酶，并评估其对五种农作物秸秆的脱木质素效果。
核心内容
针对野生型漆酶产量低制约木质纤维素降解应用的问题，该研究将裂褶菌漆酶基因经密码子优化后全基因合成，克隆至pPIC9K载体并电转化毕赤酵母GS115，经筛选高拷贝转化子后在甲醇诱导下实现分泌表达。重组漆酶最高活力达344 U/mL，SDS-PAGE显示55 kDa和70 kDa两条蛋白带，比活力为163.80，显著高于非重组形式。将重组漆酶直接处理五种农作物秸秆后，木质素损失介于1.64%（高粱秸秆）至4.83%（谷子秸秆）之间，体外干物质消化率提高8.71%至24.61%，其中谷子秸秆处理组的消化率与木质素含量呈强负相关（r=-0.99）。结果表明，该重组漆酶能有效降解秸秆木质素并提升饲料消化率，展现出作为反刍动物饲料预处理剂的工业应用潜力，同时也验证了毕赤酵母表达系统在真菌漆酶异源生产中的可行性。
创新点
首次在毕赤酵母中实现裂褶菌漆酶基因的异源表达；采用全基因合成与密码子优化策略；将重组漆酶直接用于农作物秸秆的脱木质素处理，提升反刍动物饲料消化率。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 (his4) | 异源蛋白表达 | ScomLac | 漆酶（Lac1） | 催化 | 密码子优化的裂褶菌漆酶基因，受AOX1启动子控制，分泌到胞外 |
| Pichia pastoris GS115 (his4) | 甲醇代谢调控 | AOX1 promoter | 醇氧化酶启动子 | 调控 | 甲醇诱导型强启动子，用于驱动漆酶基因表达 |
| Pichia pastoris GS115 (his4) | 蛋白分泌通路 | α-factor signal sequence | α-交配因子前导肽 | 转运 | 介导重组漆酶向胞外分泌 |
| Escherichia coli DH5α | 质粒扩增 | pPIC9K vector | — | 调控 | 穿梭载体，用于漆酶基因的克隆与毕赤酵母转化 |
关键发现
- 重组漆酶最高活力达344 U/mL（0.019 g/mL湿细胞重）
- SDS-PAGE显示55 kDa和70 kDa两条带
- 处理五种秸秆后，木质素损失1.64%（高粱秸秆）至4.83%（谷子秸秆）
- 体外干物质消化率提高8.71%（玉米秸秆）至24.61%（谷子秸秆）
- 重组漆酶比活力为163.80，非重组为56
- 谷子秸秆处理组的消化率与木质素含量呈强负相关（r=-0.99，F=213.8）。
研究结论
重组漆酶能有效降解木质素，提高作物秸秆的体外干物质消化率，具有作为反刍动物饲料预处理剂的潜力。