Characterization of an Orphan Diterpenoid Biosynthetic Operon from Salinispora arenicola
- 作者
- Meimei Xu, Matthew L. Hillwig, Amy L. Lane, Mollie S. Tiernan, Bradley S. Moore, Reuben J. Peters
- 单位
- Department of Biochemistry, Biophysics & Molecular Biology, Iowa State University; Scripps Institution of Oceanography and Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California at San Diego
- 杂志
- Journal of Natural Products（2014）
- DOI
- 10.1021/np500422d
- 所属领域
- 天然产物生物合成
- 关键词
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解决的核心问题
解析来自海洋放线菌 Salinispora arenicola CNS-205 的孤儿二萜生物合成操纵子 terp1 的功能，确定其编码酶的催化反应及最终产物。
研究策略
利用模块化代谢工程系统在大肠杆菌中重组表达 terp1 操纵子的三个基因，通过共表达、GC-MS 和 NMR 分析鉴定中间体和最终产物，并在原始菌株不同培养基发酵条件下检测产物。
研究路线图
核心内容
该研究对海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205中一个功能未知的孤儿二萜生物合成操纵子terp1进行了系统表征。通过模块化代谢工程策略，在大肠杆菌中重组表达该操纵子的三个基因，利用共表达结合GC-MS和NMR分析鉴定各步反应产物。结果显示，II类二萜环化酶SaCPS与GGPS共表达产生normal CPP，该酶含有非典型的DxDMT基序但仍有活性；I类合酶SaDTS可催化生成isopimara-8,15-diene，从2 L培养物中分离约2 mg用于结构确证，该酶缺少经典DDxDMD基序却仍具催化功能；细胞色素P450氧化酶CYP1051A1与铁氧还蛋白及还原酶共表达可将二烯烃转化为isopimara-8,15-dien-19-ol，但5 L培养仅得约100 μg，改用水稻CYP99A3替代后产量提升至约1 mg。然而，在原始菌株四种培养基纯培养条件下均未检测到相应产物，基因敲除突变株与野生型代谢谱也无差异，表明terp1操纵子虽编码从GGPP到羟基化二萜的完整途径，但在所测实验室条件下不表达，推测其可能仅在特定生态条件下被激活，或受限于原始宿主中GGPS的缺乏。
创新点
首次功能表征了来自海洋放线菌的孤儿二萜操纵子；发现 II 类二萜环化酶 SaCPS 含有非典型 DxDMT 基序但仍具有活性；发现 I 类二萜合酶 SaDTS 缺少经典 DDxDMD 基序但可催化环化；鉴定 CYP1051A1 为催化 C-19 羟基化的细胞色素 P450 氧化酶。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | Sare_1288 | SaCPS | 催化 | II 类二萜环化酶，催化 GGPP 环化生成 normal CPP |
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | Sare_1287 | SaDTS | 催化 | I 类二萜合酶，催化 CPP 生成 isopimara-8,15-diene |
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | Sare_1286 | CYP1051A1 | 催化 | 细胞色素 P450 单加氧酶，催化 C-19 羟基化生成 isopimara-8,15-dien-19-ol |
| Escherichia coli | 电子传递链 | Sare_4141 | Fdx | 能量供给 | 铁氧还蛋白，为 CYP1051A1 提供电子 |
| Escherichia coli | 电子传递链 | Sare_0646 | FdR | 能量供给 | 铁氧还蛋白还原酶，还原 Fdx |
关键发现
- SaCPS 与 GGPS 共表达产生 normal CPP，产物经去磷酸化后经 GC-MS 确认为 copalol
- SaDTS 与 SaCPS 共表达生成 isopimara-8,15-diene，从 2 L 培养物中分离约 2 mg 用于 NMR 鉴定
- CYP1051A1 与 Fdx (Sare_4141) 和 FdR (Sare_0646) 共表达生成 isopimara-8,15-dien-19-ol，但 5 L 培养仅获得约 100 μg
- 利用水稻 CYP99A3 替代后产量提高到约 1 mg
- 在 S. arenicola CNS-205 的四种不同培养基纯培养中均未检测到产物 3 和 4，PCR 基因敲除突变株与野生型的代谢谱也无差异。
研究结论
terp1 操纵子在功能上编码从 GGPP 到 isopimara-8,15-dien-19-ol 的生物合成途径，但在所测纯培养条件下 S. arenicola CNS-205 不产生该产物，推测该操纵子可能在特定生态条件（如与其他海洋生物共存）下才表达，或由于缺乏 GGPS 而限制了其在原始宿主中的产量。