Enzymatic Synthesis of Artemisinin from Natural and Synthetic Precursors
- 作者
- Shalini Bhalel, Anamika Gulati, M. Z. Abdin, P. S. Srivastava, R. A. Vishwakarma, S. K. Jain
- 单位
- Faculty of Science, Hamdard University, New Delhi, India; National Institute of Immunology, New Delhi, India
- 杂志
- Journal of Natural Products（1997）
- DOI
- 10.1021/np970024s
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素生物合成途径尚不完全清楚，且天然青蒿素产量低（0.01%-0.5%），需要阐明其生物合成酶学机制并开发便捷的放射性标记前体以研究该途径。
研究策略
建立了体外酶活测定系统，比较不同缓冲液和辅因子的影响；化学合成了新底物二氢青蒿素B并制备其氚标记物，利用该底物追踪酶促转化为青蒿素；通过硫酸铵分级沉淀部分纯化相关酶。
核心内容
本研究以青蒿（Artemisia annua L.）为材料，针对青蒿素生物合成途径不清且天然含量低（0.01%–0.5%）的问题，建立了体外酶活测定系统，并首次化学合成氚标记的二氢青蒿素B作为新底物，追踪其酶促转化为青蒿素的过程。通过比较缓冲液与辅因子组合，发现HEPES缓冲液下青蒿酸、arteannuin B和二氢青蒿素B的转化量分别为0.017、0.014和0.011 μmol/mg protein，远高于Tris-HCl体系，且150分钟时转化率最高；最优辅因子组合为ATP（0.1 mM）、NADPH+H⁺（0.1 mM）、MgSO₄（1 mM）和MnSO₄（1 mM）。经硫酸铵分级沉淀，75%–100%组分含3.1%总蛋白却富集约25%总酶活，酶活提高8倍，SDS-PAGE显示12.5和14 kD两个主要蛋白条带。氚标记底物比活达1.29×10⁹ cpm/mmol，转化后分离的青蒿素放射性为1.0×10⁴ cpm/mg protein（投入3.2×10⁵ cpm）。结果证实二氢青蒿素B是可高效放射性标记的替代前体，并支持arteannuin B为青蒿素直接前体，为阐明该途径提供了关键酶学工具。
创新点
首次合成并应用二氢青蒿素B作为青蒿素生物合成的前体底物；证明其在体外酶系统中可高效转化为青蒿素，且易于高比活放射性标记；确定了最佳缓冲液（HEPES）和辅因子组合。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua L.（青蒿） | 青蒿素生物合成途径 | — | 青蒿素合成相关酶（部分纯化，75-100%硫酸铵组分） | 催化 | 来源于80-100天叶片的细胞提取物；需要Mg2+/Mn2+、ATP和NADPH；SDS-PAGE显示12.5和14 kD条带。 |
关键发现
- HEPES缓冲液下，青蒿酸、arteannuin B、dihydroarteannuin B转化为青蒿素的量分别为0.017、0.014、0.011 μmol/mg protein
- Tris-HCl下分别为0.003、0.002、0.010。150 min时转化率最大。最优辅因子组合为ATP (0.1 mM)、NADPH+H+ (0.1 mM)、MgSO4 (1 mM)、MnSO4 (1 mM)。75-100%硫酸铵沉淀组分含有3.1%总蛋白但约25%总酶活，酶活富集8倍。SDS-PAGE显示12.5和14 kD两个主要蛋白条带。氚标记dihydroarteannuin B比活为1.29×10^9 cpm/mmol，转化后青蒿素纯化得到1.0×10^4 cpm/mg protein（以3.2×10^5 cpm投入）。青蒿素天然含量为0.01%-0.5%。
研究结论
研究建立了青蒿素体外生物合成酶测定系统，证实二氢青蒿素B可作为青蒿素合成的有效替代前体并可高效放射性标记；综合数据支持arteannuin B是青蒿素的直接前体。