Metabolic Engineering to Produce Sesquiterpenes in Yeast
- 作者
- Beth E. Jackson, Elizabeth A. Hart-Wells, Seiichi P. T. Matsuda
- 单位
- Department of Biochemistry and Cell Biology and Department of Chemistry, Rice University, Houston, Texas 77005
- 杂志
- Organic Letters（2003）
- DOI
- 10.1021/ol034231x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在酵母中高效生产倍半萜类化合物，并解决异源表达体系产量低、FPP供应不足的问题
研究策略
以酿酒酵母为底盘，利用其内源甾醇生物合成途径中的FPP，通过表达青蒿来源的epi-cedrol合酶，并组合过表达截短HMG-CoA还原酶（trHmg1p）、FPP合酶（Erg20p）以及upc2-1转录因子突变等遗传操作，提高FPP供应及向目标倍半萜的代谢流；同时采用树脂吸附法有效回收非挥发性产物epi-cedrol
核心内容
该研究以酿酒酵母为底盘，通过代谢工程手段实现倍半萜化合物epi-cedrol的异源生产。研究者将青蒿来源的epi-cedrol合酶导入酵母，利用其内源甾醇合成途径中的法尼基焦磷酸（FPP）作为前体，并系统考察了过表达截短HMG-CoA还原酶（trHmg1p）、FPP合酶（Erg20p）以及引入upc2-1转录因子突变等遗传操作对产物产量的影响。结果发现，在野生型菌株中，a型配型菌株产量（180 μg/L）显著高于α型（90 μg/L）。单独引入upc2-1突变或过表达trHmg1p并未提升产量，而组合upc2-1突变与trHmg1p过表达的菌株EYH41产量最高，达370 μg/L，为初始菌株的4倍，且优于大肠杆菌体系报道值的6倍。此外，研究采用Diaion HP-20树脂吸附回收非挥发性产物，避免了皂化处理带来的损失并提高了检测准确性。该组合策略有效提升了FPP供应及目标代谢流，证明酵母体系足以支撑新型倍半萜合酶产物的结构鉴定，为倍半萜类化合物的异源生产提供了可行平台，但当前产量仍不足以工业化，需进一步解除FPP反馈调控。
创新点
['首次在天然酵母菌株中利用内源FPP实现倍半萜异源表达', '发现a型配型比α型配型更有利于外源倍半萜合成', '组合upc2-1突变与trHmg1p过表达使产量达到370 μg/L，较未优化菌株提高4倍', '采用Diaion HP-20树脂吸附回收产物，避免了皂化处理并提高检测准确性']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/甾醇生物合成途径 | — | Epi-cedrol synthase | 催化 | 来自Artemisia annua，将FPP环化并加水生成epi-cedrol |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/甾醇生物合成途径 | HMG1 | 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (Hmg1p) | 催化 | 截除N端跨膜结构域的trHmg1p，在GAL1启动子下过表达以增加甲羟戊酸途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/甾醇生物合成途径 | ERG20 | Farnesyl pyrophosphate synthase (Erg20p) | 催化 | 过表达以提高FPP合成能力，在本研究中效果有限 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇生物合成途径调控 | UPC2 | Upc2p | 调控 | upc2-1突变（G888D）增强甾醇合成代谢流，单独使用时降低外源倍半萜产量，但与trHmg1p组合起协同作用 |
关键发现
['在野生型α型菌株JBY574中表达epi-cedrol合酶，epi-cedrol产量为90±20 μg/L', '在野生型a型菌株JBY575中产量为180±10 μg/L，说明a型配型优于α型', '单独引入upc2-1突变（CJ2-A）产量降至110±20 μg/L，单独过表达trHmg1p（BEJY7）产量为70±20 μg/L，均低于野生型', '过表达ERG20（BEJY8）产量为230±90 μg/L，但结合其他背景下未进一步提高', '组合upc2-1与trHmg1p过表达的EYH41菌株产量最高，为370±40 μg/L，是初始菌株的4倍', '相同背景下α型菌株EYH42产量为280±80 μg/L，低于a型EYH41', '该系统的产量比已报道的大肠杆菌体系（60 μg/L）高出6倍']
研究结论
通过组合upc2-1突变和截短HMG-CoA还原酶过表达，可在酿酒酵母中实现370 μg/L的倍半萜产量，足以支持新型倍半萜合酶产物的结构鉴定；该体系具有普适性，可用于生产已知的多种倍半萜，但当前产量尚不足以进行工业化生产，需进一步规避FPP反馈调控以实现更高产量