A Functional Genomics Approach to Tanshinone Biosynthesis Provides Stereochemical Insights
- 作者
- Wei Gao, Matthew L. Hillwig, Luqi Huang, Guanghong Cui, Xueyong Wang, Jianqiang Kong, Bin Yang, Reuben J. Peters
- 单位
- Institute of Chinese Materia Medica, Chinese Academy of Chinese Medical Science, Beijing 100700, China; School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China; Department of Biochemistry, Biophysics, & Molecular Biology, Iowa State University, Ames, Iowa 50011; Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
- 杂志
- Organic Letters（2009）
- DOI
- 10.1021/ol902051v
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
丹参酮生物合成途径中关键二萜合酶的鉴定及中间体立体化学的确定
研究策略
功能基因组学策略：构建丹参根cDNA文库和微阵列芯片，通过诱导表达筛选候选基因，克隆全长cDNA，异源表达并体外酶活测定，利用模块化代谢工程系统确定产物的立体化学
核心内容
该研究通过功能基因组学策略系统解析了丹参酮生物合成途径中的关键二萜合酶及其立体化学特征。研究者构建了丹参根cDNA文库和微阵列芯片，通过诱导表达筛选候选基因，克隆了SmCPS和SmKSL两个全长cDNA，并在大肠杆菌中异源表达进行体外酶活测定。结果显示，SmCPS催化GGPP生成正常立体构型的(5S,9S,10S)-CPP，而SmKSL进一步催化CPP环化生成miltiradiene，产物占比超过95%。在茉莉酸甲酯诱导条件下，SmKSL的mRNA水平在1天内升高约15倍，SmCPS也提升2倍以上。通过模块化代谢工程系统在大肠杆菌中生产了约5毫克miltiradiene，并利用NMR确定了其环己-1,4-二烯结构。在毛状根培养中，miltiradiene瞬时积累后下降，与丹参酮IIA的增加呈负相关，表明其作为途径中间体的角色。该研究首次从被子植物中鉴定了正常立体化学特异性的CPP合成酶，为丹参酮生物合成途径的完整解析提供了关键的立体化学基础。
创新点
首次从被子植物中鉴定了正常立体化学特异性CPP合成酶SmCPS和miltiradiene合成酶SmKSL；通过NMR确定了新中间体miltiradiene的结构（环己-1,4-二烯）；为丹参酮生物合成提供了立体化学基础并提出了假设性途径
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 丹参酮生物合成 | SmCPS | SmCPS | 催化 | 催化GGPP环化生成正常立体化学的CPP |
| Escherichia coli | 丹参酮生物合成 | SmKSL | SmKSL | 催化 | 催化正常CPP进一步环化重排生成miltiradiene |
| Salvia miltiorrhiza hairy root culture | 丹参酮生物合成 | SmCPS, SmKSL | SmCPS, SmKSL | 催化 | 在毛状根中受MeJA和elicitor诱导表达，参与丹参酮生物合成 |
关键发现
- SmCPS和SmKSL在诱导条件下mRNA水平增加（SmKSL在1天时约15倍，SmCPS约2倍以上）
- SmCPS催化GGPP生成正常(5S,9S,10S)-CPP
- SmKSL催化CPP环化生成miltiradiene（9），产物占>95%
- 通过模块化代谢工程系统生产约5 mg的miltiradiene用于NMR解析
- 在MeJA处理后的毛状根培养中，miltiradiene瞬时积累后下降，与丹参酮IIA增加呈负相关
研究结论
SmCPS和SmKSL是丹参酮生物合成途径中的关键酶，分别催化生成正常CPP和miltiradiene，其确定的立体化学为后续丹参酮生物合成途径研究提供了基础