Engineering Monoterpene Production in Yeast Using a Synthetic Dominant Negative Geranyl Diphosphate Synthase
- 作者
- Codruta Ignea, Marianna Pontini, Massimo E. Maffei, Antonios M. Makris, Sotirios C. Kampranis
- 单位
- Mediterranean Agronomic Institute of Chania; Plant Physiology Unit, Department of Plant Biology, Innovation Centre, University of Turin; Institute of Applied Biosciences - Centre for Research and Technology Hellas (INAB-CERTH); Department of Biochemistry, School of Medicine, University of Crete
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2014）
- DOI
- 10.1021/sb400115e
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酵母中单萜产量远低于倍半萜，原因是内源法尼基二磷酸合酶 Erg20p 的顺序反应机制使 GPP 被快速转化为 FPP，导致 GPP 前体供应不足，限制单萜合成效率。
研究策略
通过蛋白质工程将 Erg20p 改造为 GPP 合酶，并引入显性负突变（N127W/F96W）降低内源 FPP 合酶活性；进一步将工程化 Erg20p 与桧烯合酶 SpSabS1 融合，结合杂合缺失 ERG20 等菌株工程，提高单萜产量。
核心内容
针对酵母中单萜产量远低于倍半萜的问题，本研究通过蛋白质工程与菌株工程相结合的策略，改造内源法尼基二磷酸合酶 Erg20p，以增强单萜前体 GPP 的供应。研究首先基于结构设计将 Erg20p 改造为 GPP 合酶突变体，其中 F96W 和 N127W 双突变使桧烯产量提高 10.4 倍，动力学分析显示该突变体对 GPP 的解离常数较野生型提高约 30 倍，而 DMAPP 亲和力仅小幅下降。进一步将显性负突变体 Erg20p(F96W-N127W) 与桧烯合酶 SpSabS1 融合表达，利用 Erg20p 二聚化实现底物通道化，产量提升 3.5 倍。结合构建 ERG20/erg20 杂合缺失菌株 MIC2 及双质粒系统，最终桧烯产量从基础菌株的 0.051 mg/L 提升至 17.5 mg/L，总增幅达 340 倍。该成果证明显性负 GPP 合酶融合模块能在不完全阻断甾醇合成的前提下高效供给单萜前体，为其他单萜合酶的快速表征与异源生产提供了即插即用的工程平台。
创新点
1. 基于 Erg20p 结构设计 GPP 合酶突变体；2. 开发显性负突变策略，在不完全阻断甾醇合成的前提下减少 FPP 合酶活性；3. 通过 Erg20p 二聚化实现融合蛋白，将萜烯合酶锚定到 GPP 生成位点；4. 构建 ERG20/erg20 杂合缺失菌株 MIC2 及双质粒系统，实现 340 倍产量提升。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae AM94 | 异戊二烯生物合成/甲羟戊酸途径 | ERG20 | Erg20p (farnesyl diphosphate synthase) | 催化 | 内源酶，顺序催化 DMAPP+IPP→GPP→FPP，是单萜合成的主要限制因素 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 | 异戊二烯生物合成 | ERG20(F96W) | Erg20p(F96W)（GPP 合酶变体） | 催化 | F96W 点突变，对 GPP 亲和力降低约 30 倍，使单萜产量提高 3 倍 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 | 异戊二烯生物合成 | ERG20(N127W) | Erg20p(N127W)（显性负突变体） | 催化 | N127W 突变破坏二聚体内另一亚基 FPP 合酶活性，产量提高 6 倍 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 / MIC2 | 异戊二烯生物合成 | ERG20(F96W-N127W) | Erg20p(F96W-N127W)（显性负 GPP 合酶） | 催化 | 双重突变，显性负效应更强，产量提高 10.4 倍；与 SpSabS1 融合后进一步提高 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 / MIC2 | 单萜生物合成 | SpSabS1 | Salvia pomifera 桧烯合酶（SpSabS1） | 催化 | 约 94% 特异性生成桧烯，作为单萜平台报告酶 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 | 倍半萜生物合成 | SfCarS1 | Salvia fruticosa 香石竹烯合酶（SfCarS1） | 催化 | 对照倍半萜合成，产量约 9 mg/L，比单萜基础产量高约 200 倍 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 | 甲羟戊酸途径 | IDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶（IdI1p） | 催化 | 过表达提高 DMAPP/IPP 比例，增加 GPP 池，使桧烯产量提高 3 倍 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 | 甲羟戊酸途径 | PaIDS2 | Picea abies GPP 合酶（PaIDS2） | 催化 | 异源 GPP 合酶，仅使产量提高 40%，说明异源表达存在限制 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 | 甲羟戊酸途径 | HMG2(K6R) | HMG-CoA 还原酶（降解稳定突变体） | 催化 | K6R 突变减少蛋白降解，增强甲羟戊酸通量，菌株中整合多个拷贝 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 | 甾醇生物合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶（Erg9p） | 催化 | 单等位缺失减少 FPP 流向甾醇，为萜烯合成节省前体 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 衍生菌 | 异戊二烯磷酸水解 | LPP1/DPP1 | 脂质磷酸酶（Lpp1p/Dpp1p） | 催化 | 催化 FPP/GPP 水解为萜醇；其杂合缺失反而降低单萜产量，可能与前体反馈抑制有关 |
| Saccharomyces cerevisiae AM94 衍生菌 | 蛋白质降解/调控 | UBC7、SSM4、PHO86 | Ubc7p、Ssm4p、Pho86p | 调控 | HMG2 正向遗传互作因子，杂合缺失对倍半萜有促进作用，但对单萜产量无显著改善 |
| Saccharomyces cerevisiae MIC2 | 异戊二烯生物合成 | ERG20/erg20（杂合缺失） | Erg20p（部分缺失） | 催化 | 杂合缺失一个 ERG20 等位基因，降低内源 FPP 合酶水平，使融合蛋白产量达 12.9 mg/L，双质粒后达 17.5 mg/L |
关键发现
- 通过组合蛋白质工程与菌株工程，桧烯产量从 AM94 基础菌株的
- 051 mg/L 提高至 MIC2 双质粒系统的
- 5 mg/L，总提升 340 倍。其中：过表达 IDI1 提高 3 倍；异源 GPP 合酶 PaIDS2 仅提高 40%；Erg20p(A99C/L/F/W) 分别提高
- 29、1.45、1.66、1.88 倍；Erg20p(F96W) 提高 3 倍；Erg20p(N127W) 提高 6 倍；Erg20p(F96W-N127W) 提高
- 4 倍；与 SpSabS1 融合后提高
- 5 倍至
- 87 mg/L；在 MIC2 中达
- 9 mg/L，进一步增加质粒拷贝至
- 5 mg/L。动力学分析显示 F96W 对 GPP 的 Kd 为
- 36 μM，比野生型
- 43 μM 高 30 倍，而 DMAPP 亲和力仅降 2 倍。倍半萜对照香石竹烯产量约 9 mg/L，是单萜初始产量的约 200 倍。
研究结论
本研究克服了酵母 FPP 合酶顺序反应对单萜合成的限制，通过合成显性负 GPP 合酶-萜烯合酶融合体，在不影响生长的情况下实现桧烯高产。该合成模块可整合到其他工程菌株，MIC2 菌株及质粒系统可作为单萜合酶表征和途径解析的即插即用平台。