Enhancing Tolerance to Short-Chain Alcohols by Engineering the Escherichia coli AcrB Efflux Pump to Secrete the Non-native Substrate n-Butanol
- 作者
- Michael A. Fisher, Sergey Boyarskiy, Masaki R. Yamada, Niwen Kong, Stefan Bauer, Danielle Tullman-Ercek
- 单位
- Energy Biosciences Institute, University of California Berkeley; Department of Bioengineering, University of California Berkeley; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California Berkeley; Department of Molecular and Cell Biology, University of California Berkeley
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2014）
- DOI
- 10.1021/sb400065q
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
短链醇类生物燃料对微生物生产宿主的毒性限制了燃料产量，需要工程化外排泵将燃料排出细胞以提高耐受性并促进产物分泌。
研究策略
对大肠杆菌AcrB外排泵进行两轮定向进化（易错PCR随机突变+生长竞争筛选），在正丁醇存在下选择生长增强的突变体，并鉴定关键单氨基酸突变；通过化学（CCCP）和遗传（质子中继突变）方法验证外排机制。
研究路线图
核心内容
本研究针对短链醇类生物燃料对生产宿主的毒性限制产量这一核心问题，对大肠杆菌AcrB外排泵进行了两轮易错PCR定向进化与生长竞争筛选，以获得能够主动分泌非天然底物正丁醇的变体。筛选获得的AcrB变体Var1和Var2在0.7%正丁醇条件下培养6小时的细胞密度比野生型分别提高30%和25%；第二代变体Var1-2将晚期对数期生长速率常数提高25%，6小时细胞密度提升37%，且细胞内丁醇隔室化吸收降低约15%。关键单氨基酸突变Ile466Phe、Met355Leu和Ser880Pro被鉴定为功能位点。化学解偶联剂CCCP及质子中继突变实验证实该耐受性源于主动外排机制。变体还增强了对乙醇、异丁醇及C5-C7正醇的耐受性，但对更长链醇及抗生素无交叉增强。该策略通过主动外排降低胞内毒物浓度，而非被动耐受，为微生物燃料生产提供了一种可调控小分子跨膜浓度梯度的通用工具。
创新点
首次通过实验室定向进化获得能分泌非天然底物（短链醇）的RND型外排泵；相比已有策略，通过主动外排而非阻止进入或全局应激响应提高耐受性；鉴定出关键单突变Ile466Phe、Met355Leu、Ser880Pro，并验证其功能。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH10B | AcrAB-TolC外排泵系统 | acrB | AcrB | 转运 | 内膜外排泵蛋白，本研究定向进化的靶标；突变体Var1（Ile370Thr, Ile466Phe, Gly689Asp, Ala942Thr）和Var2（Glu130Gly, Glu269Gly, Met355Leu, Val448Ala, Thr495Ala） |
| Escherichia coli DH10B | AcrAB-TolC外排泵系统 | acrA | AcrA | 转运 | 膜融合蛋白，与外膜蛋白TolC及内膜蛋白AcrB共同形成三组分外排泵 |
| Escherichia coli DH10B | AcrAB-TolC外排泵系统 | tolC | TolC | 转运 | 外膜通道蛋白，负责将底物排出细胞外 |
| Escherichia coli MG1655 | AcrAB-TolC外排泵系统 | acrB | AcrB | 转运 | 验证野生型背景中变体增强耐受；ΔacrB敲除菌株中表达变体也观察到了相对野生型AcrB的耐受增强 |
| Escherichia coli BW25113 | AcrAB-TolC外排泵系统 | acrB | AcrB | 转运 | ΔacrB敲除菌株用于比较生长表现 |
关键发现
- 筛选出的AcrB变体Var1和Var2在0.7%正丁醇条件下培养6小时细胞密度比野生型AcrB分别提高30%和25%
- 第二代变体Var1-2比野生型AcrB提高晚期对数期生长速率常数25%、6小时细胞密度提高37%
- 表达Var1-2的细胞对正丁醇的隔室化吸收比野生型AcrB降低约15%（0.552±0.046 μg/mL 对 0.652±0.020 μg/mL，p<0.01）
- 单突变Ile466Phe、Met355Leu、Ser880Pro分别负责相应变体的耐受性
- 变体也增强对6%乙醇、0.8%异丁醇、0.2%正戊醇、0.1%正己醇、0.04%正庚醇的耐受，但对正辛醇、3-辛醇、氨苄青霉素（20 mg/L）、氯霉素（2.1 mg/L）无增强
- 加入CCCP或引入Asp407Ala/Asp408Ala突变会消除变体的耐受表型。
研究结论
通过定向进化可改造大肠杆菌RND外排泵AcrB，使其主动外排非天然底物短链醇，降低胞内丁醇浓度，显著提高菌株在醇类存在下的生长耐受性；该策略为微生物燃料和化学品的生产提供了一种可调控小分子跨膜浓度梯度的工具。