L-Gulono-1,4-lactone oxidase expression rescues vitamin C-deficient Arabidopsis (vtc) mutants
- 作者
- Jessica A. Radzio, Argelia Lorence, Boris I. Chevone, Craig L. Nessler
- 单位
- Department of Plant Pathology, Physiology and Weed Science, Virginia Polytechnic Institute and State University, 413 Price Hall, Blacksburg, VA 24061-0331, USA
- 杂志
- Plant Growth Regulation（2004）
- DOI
- 10.1023/B:PLAN.0000023671.99451.1d
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物中维生素C（L-抗坏血酸）的生物合成途径尚不完全清楚，尤其是是否存在类似动物的合成途径；维生素C缺陷拟南芥vtc突变体能否通过表达动物途径末端酶GLOase来恢复维生素C含量和正常表型，从而揭示替代途径的存在
研究策略
将动物途径末端酶L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶（GLOase）的cDNA置于组成型35S启动子下，通过花序浸蘸法转化拟南芥野生型和五种vtc突变体（vtc1-1, vtc2-1, vtc2-2, vtc3-1, vtc4-1），建立纯合转基因系，比较叶片抗坏血酸含量和植株表型
核心内容
该研究将大鼠维生素C合成途径末端酶L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶（GLOase）的cDNA置于35S启动子下，通过花序浸蘸法转化拟南芥野生型及五种维生素C缺陷vtc突变体，旨在检验动物替代途径能否在植物中恢复维生素C合成。结果显示，野生型表达GLOase后叶片维生素C含量最高增加2倍；五种vtc突变体表达该酶后维生素C含量均恢复至野生型水平或更高，其中最高达野生型的3倍，且超过90%的抗坏血酸为还原形式。vtc1-1突变体叶片维生素C含量仅为野生型的25-30%，源于GMPase活性降低，而表达GLOase后其生长与开花表型完全恢复正常。体外实验还表明GLOase对植物途径底物L-半乳糖-1,4-内酯的活性约为动物底物的85%。这一结果证明植物中存在独立于D-甘露糖途径的替代维生素C合成通路，且通过导入动物途径末端酶进行代谢工程改造可有效提升植物维生素C含量，为作物营养强化提供了可行策略。
创新点
首次在拟南芥全部五种维生素C缺陷vtc突变体中表达动物途径GLOase，证明其可完全或部分恢复维生素C含量（最高达野生型的3倍），并恢复突变体的生长与开花表型；为植物中存在替代维生素C合成途径提供了直接证据
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia生态型） | 动物维生素C生物合成途径（替代途径） | GLOase（大鼠cDNA） | L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶（GLOase, EC 1.1.3.8） | 催化 | 组成型35S启动子控制表达；催化L-古洛糖酸-1,4-内酯（GUL）或其异构体L-半乳糖-1,4-内酯（GL）氧化生成L-抗坏血酸 |
| 拟南芥vtc1-1突变体 | Smirnoff-Wheeler途径（D-甘露糖途径） | VTC1 | GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMPase, EC 2.7.7.13） | 催化 | vtc1-1在第64位点突变（Pro22Ser）导致GMPase活性大幅降低；GLOase表达可绕过GDP-甘露糖合成缺陷，使维生素C含量恢复至野生型水平或更高 |
| 拟南芥（野生型和vtc突变体） | Smirnoff-Wheeler途径 | （未指定） | L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶（GLDase） | 催化 | 植物自身途径末端酶，定位于线粒体内膜；在vtc1-1中活性正常；GLOase因在ER表达而可能利用胞质中的GL库，绕过GLDase的线粒体限制 |
| 拟南芥vtc2-1, vtc2-2, vtc3-1, vtc4-1突变体 | Smirnoff-Wheeler途径 | VTC2, VTC3, VTC4 | VTC2编码未知功能蛋白；VTC3/VTC4基因未克隆 | 调控 | 这些突变体中多数途径酶活性正常，推测缺陷可能在GDP-L-半乳糖向L-半乳糖转化步骤或调控因子上；GLOase表达仍可恢复维生素C含量至野生型水平或更高 |
关键发现
- 野生型拟南芥表达GLOase后，叶片维生素C含量最多增加2倍（Figure 2）
- 五种vtc突变体表达GLOase后，维生素C含量均恢复至野生型水平或更高，最高达野生型的3倍（Figure 3）
- vtc1-1突变体叶片维生素C含量仅为野生型的25-30%，源于GMPase（VTC1）活性降低
- 所有转基因植株中超过90%的抗坏血酸为还原形式
- 表达GLOase的vtc1-1植株生长和开花表型恢复正常（Figure 4）
- 体外实验表明GLOase对植物途径底物L-半乳糖-1,4-内酯（GL）的活性约为动物底物L-古洛糖酸-1,4-内酯（GUL）的85%（引用Kiuchi et al., 1982）
研究结论
植物中存在一条或多条独立于D-甘露糖途径的替代维生素C合成途径，能够绕过vtc突变体中的GDP-甘露糖合成缺陷；动物途径末端酶GLOase在植物中的表达可有效合成维生素C并挽救vtc突变体的缺乏表型，提示通过代谢工程在植物中利用动物途径提高维生素C含量是可行的