T-DNA activation tagging as a tool to isolate regulators of a metabolic pathway from a genetically non-tractable plant species
- 作者
- Leslie van der Fits, Frédérique Hilliou, Johan Memelink
- 单位
- Institute of Molecular Plant Sciences, Clusius Laboratory, Leiden University, Wassenaarseweg 64, 2333 AL, Leiden, The Netherlands
- DOI
- 10.1023/A:1013087011562
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何从遗传上难以操作的植物物种长春花（Catharanthus roseus）中分离调控复杂次生代谢途径（萜类吲哚生物碱，TIA）生物合成基因的调控因子
研究策略
利用T-DNA激活标签技术，将携带CaMV 35S增强子的T-DNA随机插入长春花悬浮细胞基因组；以TDC酶毒性底物4-甲基色氨酸（4-mT）进行大规模筛选，获得抗性细胞系；通过Northern blot进一步筛选Tdc和Str表达增高的细胞系；通过质粒拯救克隆被激活的基因，并分析其功能
核心内容
该研究首次将T-DNA激活标签技术应用于遗传上难以操作的长春花悬浮细胞，旨在分离调控萜类吲哚生物碱生物合成途径的转录因子。研究者将携带CaMV 35S增强子的T-DNA随机插入基因组，利用色氨酸脱羧酶（TDC）的毒性底物类似物4-甲基色氨酸进行大规模筛选：在0.2 mM浓度下，Tdc过表达细胞正常生长而对照严重受抑，随后以0.4 mM进行严格筛选。六次独立实验共获得约40至50万个稳定转化体，经筛选得到281个抗性愈伤组织，其中20个细胞系稳定高表达Tdc，6个同时高表达Tdc和Str。从细胞系46中通过质粒拯救获得1.6 kb侧翼DNA，编码AP2/ERF转录因子ORCA3，证实其是初级和次级代谢的主调控因子。该方法利用代谢酶底物类似物作为直接筛选标记，实现了对数十万转化细胞的高效筛选，证明激活标签技术可有效应用于非模式植物的次生代谢调控基因发掘。
创新点
1) 首次将T-DNA激活标签技术应用于遗传非模式植物长春花；2) 利用代谢酶的毒性底物类似物直接作为筛选标记，实现了对数十万转化细胞的高效筛选；3) 分离出ORCA3转录因子，证实其是初级和次级代谢的主调控因子
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 长春花悬浮细胞系BIX（Catharanthus roseus cell line BIX） | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | Tdc | 色氨酸脱羧酶（TDC） | 催化 | 催化L-色氨酸脱羧生成色胺，是TIA生物合成的早期关键酶，也作为4-mT筛选的靶标 |
| 长春花悬浮细胞系BIX（Catharanthus roseus cell line BIX） | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | Str | 异胡豆苷合酶（STR） | 催化 | 催化由TDC产生的色胺与裂环马钱子苷缩合形成异胡豆苷，用于检验标签是否激活了TIA途径的广谱调控因子 |
| 长春花悬浮细胞系BIX（Catharanthus roseus cell line BIX） | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成及初级代谢 | Orca3 | ORCA3（AP2/ERF结构域转录因子） | 调控 | 由T-DNA激活标签在细胞系46中激活，受茉莉酸甲酯诱导，是初级和次级代谢的主调控因子 |
关键发现
- 在0.2 mM 4-甲基色氨酸（4-mT）下，Tdc过表达细胞生长正常而对照严重受抑
- 4 mM 4-mT用于严格筛选。6次独立标签实验共获得约400,000-500,000个稳定转化体，经4-mT筛选得到281个生长愈伤组织，其中180个可在液体培养基中生长，20个细胞系稳定高表达Tdc，其中6个同时高表达Tdc和Str。细胞系46含1个T-DNA拷贝，质粒拯救获得1.6 kb侧翼DNA，编码ORCA3（AP2/ERF转录因子）。细胞系A42含1个拷贝，拯救得到4.8 kb DNA，编码一个未知功能蛋白
- B17拯救2.0 kb无同源序列
- II-37拯救0.2 kb无同源序列。长春花单倍体基因组约8×10^8 bp，约400,000-500,000个转化体（平均每基因组2个T-DNA插入）对2 kb DNA区域的覆盖概率约为90%
研究结论
T-DNA激活标签技术可成功应用于遗传上难以操作的长春花，结合毒性底物筛选和表达水平筛选，能够有效分离参与次生代谢途径调控的基因，所分离的ORCA3是TIA生物合成的关键转录调控因子，证明该方法具有广泛适用性