Catharanthus roseus G-box binding factors 1 and 2 act as repressors of strictosidine synthase gene expression in cell cultures
- 作者
- Yann Siberil, Sandrine Benhamron, Johan Memelink, Nathalie Giglioli-Guivarc'h, Martine Thiersault, Bertrand Boisson, Pierre Doireau, Pascal Gantet
- 单位
- Université de Tours, EA 2106, Biomolécules et Biotechnologies Végétales, UFR des Sciences et Techniques, Laboratoire de Physiologie Végétale, Parc de Grandmont, 37200 Tours, France; Institute of Molecular Plant Sciences, Clusius Laboratory, Wassenaarseweg 64, 2333 AL Leiden, Netherlands
- 杂志
- Plant Molecular Biology（2001）
- DOI
- 10.1023/A:1010650906695
- 所属领域
- 植物分子生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明长春花中G-box结合因子CrGBF1和CrGBF2对苦苷合成酶（Str）基因表达的调控作用，以及它们是否通过直接结合Str启动子中的G-box元件发挥功能。
研究策略
从长春花幼苗中克隆Crgbf1和Crgbf2 cDNA，通过序列分析、Southern/Northern blot分析基因拷贝数与表达模式；用大肠杆菌表达重组蛋白，通过竞争性EMSA和饱和结合实验测定与不同G-box元件的结合特异性及解离常数；通过基因枪瞬时共转化长春花细胞，检测CrGBF1/2对Str启动子及G-box缺失突变体活性的影响。
核心内容
该研究从长春花中克隆了两个编码G-box结合因子的cDNA，分别命名为Crgbf1和Crgbf2。序列分析显示二者编码的bZIP蛋白分别含426和394个氨基酸，属于不同的GBF家族。体外结合实验表明，两个重组蛋白对类I G-box元件的亲和力最高，其中CrGBF1对SR和GBCI的离解常数分别为3.5 nM和2 nM，CrGBF2对SR、GBCI和GBCII的离解常数为2.5、1.6和2.1 nM，而对其他元件的结合较弱。在基因枪瞬时共转化实验中，正义链Crgbf1或Crgbf2可使Str启动子活性降低约50%，而反义链无此抑制作用；当启动子中-108至-103位的G-box（CACGTG）缺失后，CrGBF2的抑制完全消失，CrGBF1仅保留微弱抑制。结果表明这两个蛋白通过直接结合Str启动子中的G-box元件作为转录抑制子发挥作用，从而参与长春花中萜类吲哚生物碱生物合成的负向调控，为理解TIA途径的转录调控网络提供了新的分子依据。
创新点
首次从长春花中克隆并鉴定两个G-box结合因子CrGBF1和CrGBF2，证明二者属于不同GBF家族；通过体外结合实验和体内瞬时转化实验证明它们作为转录抑制子，直接结合Str启动子G-box并下调其表达。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus 细胞悬浮培养系 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | Crgbf1 | CrGBF1 | 调控 | G-box结合因子，bZIP转录因子，作为Str基因表达的转录抑制子 |
| Catharanthus roseus 细胞悬浮培养系 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | Crgbf2 | CrGBF2 | 调控 | G-box结合因子，bZIP转录因子，作为Str基因表达的转录抑制子 |
| Catharanthus roseus 细胞悬浮培养系 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | Str | Strictosidine synthase | 催化 | 编码苦苷合成酶，催化TIA生物合成关键步骤；其启动子含G-box被CrGBF1/2结合 |
| Catharanthus roseus 细胞悬浮培养系 | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | Tdc | Tryptophan decarboxylase | 催化 | 编码色氨酸脱羧酶，其启动子含G-box类似序列（AACGTG），CrGBF1/2也以较低亲和力结合 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | Crgbf1, Crgbf2 | 重组His-CrGBF1, 重组His-CrGBF2 | 调控 | 用于表达重组蛋白进行体外DNA结合实验 |
关键发现
- Crgbf1和Crgbf2 cDNA全长分别为1875 bp和1904 bp，编码426个氨基酸（45 kDa）和394个氨基酸（41.7 kDa）的bZIP蛋白
- CrGBF1对类I G-box（SR、GBCI）的Kd分别为3.5 nM和2 nM，对类II G-box（GBCII）为11.2 nM，对GTDC为10.5 nM，对C-box为14 nM
- CrGBF2对SR、GBCI、GBCII、GTDC、CB的Kd分别为2.5、1.6、2.1、3.9、26 nM
- 瞬时共表达Crgbf1或Crgbf2正义链使Str启动子活性降低50%，而反义链或空载体无此效应
- G-box缺失的Str启动子（BH-NR）不被CrGBF2抑制，CrGBF1仅有微弱抑制作用。
研究结论
CrGBF1和CrGBF2是长春花中Str基因的转录抑制子，通过直接与Str启动子中-108至-103的G-box（CACGTG）结合而发挥抑制作用，提示它们在萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的调控中具有重要功能。