Microbial engineering for the production of advanced biofuels
- 作者
- Pamela P. Peralta-Yahya, Fuzhong Zhang, Stephen B. del Cardayre, Jay D. Keasling
- 杂志
- Nature（2012）
- DOI
- 10.1038/nature11478
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过微生物代谢工程和合成生物学手段高效生产与石油基燃料性质相近、可直接用于现有基础设施的先进生物燃料，并解决产量、宿主耐受性、途径调控及商业化中的关键瓶颈。
研究策略
系统综述了面向先进生物燃料的微生物代谢工程策略，包括醇类、异戊二烯类、脂肪酸类和聚酮类生物燃料途径的构建与优化；结合数据驱动（组学、代谢模型）与合成生物学工具（动态传感器-调节系统、蛋白支架、启动子/终止子工程、RBS设计等）对宿主和代谢途径进行改造，并讨论商业化进展与挑战。
核心内容
该研究系统综述了利用微生物代谢工程和合成生物学手段生产先进生物燃料的策略与进展。作者围绕醇类、异戊二烯类、脂肪酸类和聚酮类四条主要燃料合成途径，介绍了通过筛选多来源酶组装异源途径、敲除竞争通路、替换关键酶以及产物在线移除等手段进行宿主改造的思路。同时整合了组学数据、代谢模型预测与动态传感器-调节系统、合成蛋白支架等合成生物学工具，以实现途径通量优化和代谢的动态调控。 关键结果包括：在大肠杆菌中构建的合成丁醇途径经多物种酶组合和产物移除后，产量达30 g/L，显著高于梭菌天然发酵约13 g/L的丁醇耐受性上限；2-酮酸途径在大肠杆菌中产异丁醇达22 g/L；工程化甲羟戊酸途径使大肠杆菌和酿酒酵母分别产amorphadiene达27 g/L和40 g/L。此外，合成蛋白支架使甲羟戊酸产量提高77倍，动态调控使脂肪酸乙酯产量提高3倍。这些数据表明，通过系统性代谢途径设计和调控工具集成，微生物生产先进生物燃料在技术上已具备可行性，但产量和产率仍需接近理论值85%方具备商业化经济性，放大至600 m³反应器及拓展非粮原料是未来关键方向。
创新点
综述性文章，整合了多种先进生物燃料的代谢途径设计思路；具体创新包括：用生化性质选定的多来源酶组装合成丁醇途径、利用2-酮酸途径生产异丁醇、通过甲羟戊酸途径高产异戊二烯类燃料、反向β-氧化生产脂肪酸和醇、聚酮合酶工程定制燃料结构，以及动态传感器-调节系统和合成蛋白支架等动态/空间调控手段。
研究对象（28）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium spp. | 丁醇合成途径 | — | THL, HBD, CRT, BCD, AAD, BDH | 催化 | 天然梭菌丁醇途径；受慢生长和丁醇耐受性(约13 g/L)限制，且酶可逆、氧敏感、辅因子特异性受限 |
| Escherichia coli | 丁醇合成途径 | — | NADH依赖的trans-enoyl-CoA reductase | 催化 | 人工合成丁醇途径关键酶，避免梭菌butyryl-CoA dehydrogenase复合物的可逆与氧敏感问题；结合敲除竞争途径、提高NADH/乙酰-CoA/ATP池及产物在线移除，丁醇达30 g/L |
| Escherichia coli | 丁醇合成途径 | — | 乙酰-CoA脱羧酶、乙酰乙酰-CoA合酶 | 催化 | 替代硫解酶生成乙酰乙酰-CoA，ATP驱动并释放CO2 |
| Escherichia coli | 2-酮酸途径（Ehrlich途径） | — | 2-酮酸脱羧酶(KDC)、醇脱氢酶(ADH)、乙酰乳酸合酶(ALS) | 催化 | 利用氨基酸前体合成异丁醇；过表达2-酮异戊酸生物合成基因、删除竞争途径并引入B. subtilis ALS，异丁醇达22 g/L |
| Corynebacterium glutamicum | 2-酮酸途径 | — | 内源2-酮酸途径酶 | 催化 | 利用该菌高氨基酸生产能力工程化异丁醇合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 2-酮酸途径 | — | 内源2-酮异戊酸途径酶 | 催化 | 内源途径上调并定位于胞质，提高异丁醇产量 |
| Clostridium cellulolyticum | 2-酮酸途径 | — | 内源2-酮酸途径酶 | 催化 | 从结晶纤维素经整合生物加工直接产异丁醇 |
| Synechococcus elongatus | 2-酮酸途径 | — | 内源2-酮酸途径酶 | 催化 | 光合自养微生物，直接从CO2产异丁醇/异丁醛 |
| Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha) | 2-酮酸途径 | — | 内源2-酮酸途径酶 | 催化 | 以电化学甲酸盐为能源从CO2产异丁醇 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | — | AACT, HMGS, HMGR, MK, PMK, PMD, IPPS, FPPS | 催化 | 异戊二烯前体合成；amorphadiene产量达27 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | — | AACT, HMGS, HMGR, MK, PMK, PMD, IPPS, FPPS | 催化 | amorphadiene产量达40 g/L；甲羟戊酸激酶受FPP等下游中间产物反馈抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae (异源表达) | 甲羟戊酸途径 | — | 甲羟戊酸激酶 (MK) 来自Methanosarcina mazei | 催化 | 抗反馈抑制同源酶，用于解除FPP等中间产物对通量的抑制 |
| Escherichia coli; Saccharomyces cerevisiae | 异戊二烯途径 | — | bisabolene synthase（来自Abies grandis） | 催化 | 从FPP合成bisabolene，两菌产量均超过900 mg/L；其晶体结构用于指导改造 |
| Escherichia coli | 异戊二烯途径 | — | 磷酸酶（来自Bacillus subtilis cDNA文库） | 催化 | 催化IPP去磷酸化生成isopentenol |
| Escherichia coli (共培养) | 异戊二烯途径 | — | geranyl diphosphate synthase (GPPS), pinene synthase (PS) | 催化 | 用离子液体预处理柳枝稷为唯一碳源，pinene产量1.5 mg/L |
| Escherichia coli | 脂肪酸生物合成途径 | tesA (图中标注) | 截短胞质硫酯酶 (TesA) | 催化 | 水解acyl-ACP释放游离脂肪酸；结合敲除β-氧化产量达1.2 g/L |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生途径 (脂肪醇) | — | 酰基-CoA合酶、酰基-CoA还原酶 | 催化 | 将脂肪酸活化为acyl-CoA后还原为脂肪醇，最高产量60 mg/L |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生途径 (甲基酮) | — | 硫酯酶（β-酮酰基-CoA水解酶） | 催化 | β-氧化前三步生成β-酮酰基-CoA，水解后脱羧生成C11-C15甲基酮，产量380 mg/L |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生途径 (FAEE/FAME) | atfA (图中标注) | 蜡酯合酶 (AtfA) | 催化 | acyl-CoA与乙醇酯化生成FAEE，产量1.5 g/L |
| Escherichia coli (异源表达) | 烷烃生物合成途径 | — | 酰基-ACP还原酶 (AAR)、醛脱羧酶 (ADC) | 催化 | 源自蓝细菌，将acyl-ACP还原为脂肪醛并脱羧为烷烃 |
| Escherichia coli | 端烯烃生物合成途径 | — | 细胞色素P450脂肪酸脱羧酶 (OleTJE) | 催化 | 催化脂肪酸脱羧氧化生成端烯烃 (1-alkene) |
| Escherichia coli | 反向β-氧化途径 | yqeF, ydiO (图中标注) | 硫解酶 (YqeF)、烯酰-CoA还原酶 (YdiO) | 催化 | 过表达脂肪酸降解酶并全局去调控，产约7 g/L脂肪酸和约14 g/L正丁醇 |
| Escherichia coli (异源表达) | 聚酮化合物合成途径 | — | 模块化I型聚酮合酶 (PKS) | 催化 | 通过AT结构域改造、模块缺失/替换/插入定制烃类结构，用于先进燃料 |
| Escherichia coli | 生物燃料耐受性 | — | 外排泵 | 转运 | 从43个候选泵中筛选表达一个，提高E. coli在柠檬烯中的存活率并增加产量 |
| Escherichia coli | FAEE生物合成途径 | — | 酰基-CoA生物传感器及其同源调控因子 | 调控 | 动态传感器-调节系统(DSRS)，按酰基-CoA浓度动态调节途径，FAEE产量提高3倍 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | — | 合成蛋白支架 | 区室化 | 空间组装代谢酶协同催化，甲羟戊酸产量提高77倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜合成/甲羟戊酸途径 | — | NADPH依赖的谷氨酸脱氢酶 | 调控 | 代谢模型预测敲除可提高NADPH可用性；实际敲除后倍半萜产量近翻倍 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2 | 异戊二烯途径 | — | farnesene synthase (FS) | 催化 | Amyris工业酵母菌株生产farnesene，加氢后得到farnesane |
关键发现
- 乙醇能量含量仅为汽油的70%
- 生物柴油为D2柴油的91%
- 丁醇为汽油的84%。梭菌丁醇发酵受丁醇耐受性约13 g/L限制。在E. coli中构建的合成丁醇途径通过多物种酶组合、敲除竞争途径及产物在线移除，发酵罐中丁醇产量达30 g/L。2-酮酸途径在E. coli中产异丁醇达22 g/L（过表达2-酮异戊酸基因、删除竞争途径并替换为B. subtilis乙酰乳酸合酶）。工程化甲羟戊酸途径使E. coli产amorphadiene达27 g/L，S. cerevisiae达40 g/L。E. coli和S. cerevisiae中bisabolene产量均超过900 mg/L。E. coli共培养从离子液体预处理的柳枝稷产pinene仅1.5 mg/L。过表达硫酯酶并敲除β-氧化使游离脂肪酸达1.2 g/L。脂肪醇最高60 mg/L
- C11-C15甲基酮380 mg/L
- FAEE 1.5 g/L。反向β-氧化可产约7 g/L脂肪酸和约14 g/L正丁醇。合成蛋白支架使E. coli甲羟戊酸产量提高77倍
- 动态传感器-调节系统使FAEE产量提高3倍。代谢模型预测敲除NADPH依赖的谷氨酸脱氢酶可使S. cerevisiae倍半萜产量提高10倍，实际敲除后产量近翻倍。表达外排泵可提高E. coli在柠檬烯中的存活与产量。酵母对丁醇耐受性大于20 g/L
- Gevo通过闪蒸分离使异丁醇产量达理论产率的90%以上。E. coli脂肪酸生物合成速率约0.3 g/L/h/g干细胞重。
研究结论
先进生物燃料已可通过多种代谢途径在微生物中生产，但商业化仍面临经济性挑战：需使产量和产率达到理论产率的85%左右，并放大到600 m³以上反应器；酵母、E. coli等宿主各有优劣。未来应进一步优化途径通量、扩展非粮原料、发展动态调控和蛋白质工程，最终推动先进生物燃料市场化。