高级醇 · 代谢工程文献库

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Functional Characterization of a New Bifunctional Terpene Synthase LpNES1 from a Medicinal Plant Laggera pterodonta

作者
Zhan-Ku Shi, Xiao-Wei Gong, Jiang-Yuan Zhao, Ming-Gang Li, Xiu-Lin Han, Meng-Liang Wen
单位
National Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan, Key Laboratory of Microbial Diversity in Southwest China, Ministry of Education, Yunnan Institute of Microbiology, School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming 650091, Yunnan, CHINA; R&D Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co., Ltd., Kunming 650231, Yunnan, CHINA
杂志
Journal of Oleo Science（2022）
DOI
10.5650/jos.ess21172
所属领域
代谢工程
关键词
(E)-nerolidolLaggera pterodontaessential oilnerolidol/linalool synthase
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解决的核心问题

从药用植物翼齿六棱菊（Laggera pterodonta）中鉴定负责倍半萜生物合成的萜烯合酶，并阐明其功能。

研究策略

基于转录组分析筛选茉莉酸甲酯诱导上调的候选萜烯合酶基因，通过原核表达与体外酶活测定、酵母体内重构、亚细胞定位及组织表达分析进行功能表征。

研究路线图

100%
研究问题
翼齿六棱菊倍半萜
合成酶鉴定与功能
策略
转录组分析+异源表达
多维度功能验证
关键改造1
候选基因克隆与
MeJA诱导表达分析
关键改造2
原核表达+体外酶活
底物特异性测定
关键改造3
酵母体内重构
底物偏好性验证
关键改造4
亚细胞定位+组织表达
表达模式分析
结果
双功能酶LpNES1鉴定
底物偏好FPP生成橙花叔醇
结论
LpNES1定位于细胞质
合成(E)-橙花叔醇参与防御与花香
用于微生物异源生产
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核心内容

从药用植物翼齿六棱菊中克隆并功能表征了一个新的双功能萜烯合酶基因LpNES1。该基因开放阅读框长1749 bp，编码493个氨基酸，经茉莉酸甲酯处理后转录水平上调约8倍。体外酶活测定显示，重组LpNES1以GPP和FPP为底物时分别生成芳樟醇和(E)-橙花叔醇，后者为主要产物并伴随微量β-法尼烯，但不利用GGPP。在酿酒酵母中重构该基因时，仅检测到(E)-橙花叔醇和微量β-法尼烯，未产生单萜，表明其体内底物偏好FPP。亚细胞定位实验证实LpNES1定位于细胞质，组织表达分析显示其在花蕾和叶中的转录水平分别比根高约300倍和180倍。结果表明LpNES1在植物体内负责从FPP特异性合成(E)-橙花叔醇，可能参与防御反应与花香形成，该基因可作为微生物异源生产(E)-橙花叔醇的代谢工程元件。

创新点

首次从L. pterodonta中克隆并功能表征一种新的双功能萜烯合酶LpNES1；体外可催化GPP和FPP分别生成芳樟醇和(E)-橙花叔醇；在酵母体内仅利用FPP产生倍半萜，揭示了其底物偏好性；该基因可作为微生物合成(E)-橙花叔醇的关键元件。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Laggera pterodonta 细胞质甲羟戊酸(MVA)通路 LpNES1 LpNES1 催化 植物内源萜烯合酶，催化FPP生成(E)-橙花叔醇，表达受MeJA诱导，花蕾和叶中高表达
Escherichia coli Rosetta (DE3) 体外酶促反应 LpNES1 LpNES1 催化 重组蛋白体外以GPP和FPP为底物分别生成芳樟醇和(E)-橙花叔醇，不利用GGPP
Saccharomyces cerevisiae BY4742 甲羟戊酸(MVA)通路 OP-LpNES1 LpNES1 催化 酵母中重构后仅产生(E)-橙花叔醇及微量β-法尼烯，未产生芳樟醇
Saccharomyces cerevisiae BY4742 甲羟戊酸(MVA)通路 ERG20^WW ERG20^WW (F96W-N127W) 催化 突变的法尼基焦磷酸合酶，优先合成GPP，与LpNES1共表达以提高GPP池，但仍未产生单萜
Nicotiana benthamiana 无 LpNES1-GFP LpNES1-GFP融合蛋白 区室化 农杆菌瞬时表达后荧光显微镜观察，确认LpNES1定位于细胞质

关键发现

  1. LpNES1基因经茉莉酸甲酯处理后转录水平显著上调8倍
  2. 其ORF长1749 bp，编码493个氨基酸，理论pI 5.69，分子量56.9 kDa
  3. 重组LpNES1以GPP为底物生成芳樟醇，以FPP为底物生成(E)-橙花叔醇及微量β-法尼烯（不利用GGPP）
  4. 在酵母中重构时仅产生(E)-橙花叔醇和微量β-法尼烯，未检测到单萜
  5. LpNES1在花蕾和叶中的表达量分别比根高约300倍和180倍
  6. 亚细胞定位实验表明LpNES1定位于细胞质。

研究结论

LpNES1是一种定位于细胞质的双功能萜烯合酶，在植物体内负责从FPP特异性合成(E)-橙花叔醇，可能参与植物防御和花香形成；该基因可用于微生物中异源生产(E)-橙花叔醇，为代谢工程提供重要元件。