The seco-iridoid pathway from Catharanthus roseus
- 作者
- Karel Miettinen, Lemeng Dong, Nicolas Navrot, Thomas Schneider, Vincent Burlat, Jacob Pollier, Lotte Woittiez, Sander van der Krol, Raphaël Lugan, Tina Ilc, Robert Verpoorte, Kirsi-Marja Oksman-Caldentey, Enrico Martinoia, Harro Bouwmeester, Alain Goossens, Johan Memelink, Danièle Werck-Reichhart
- 杂志
- Nature Communications（2014）
- DOI
- 10.1038/ncomms4606
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
裂环环烯醚萜（seco-iridoid）生物合成途径的最后四个酶未知，导致长春花中单萜吲哚生物碱（如长春碱和长春新碱）的可持续生物技术生产受阻。
研究策略
整合转录组学与蛋白质组学进行基因发现，结合体外生化表征，并在本氏烟草中通过瞬时共表达重构整个途径以验证功能。
核心内容
该研究通过整合转录组学与蛋白质组学，从长春花中鉴定出裂环环烯醚萜生物合成途径缺失的四个酶：8-HGO以NAD+为辅因子氧化8-羟基香叶醇；IO（CYP76A26）催化iridodial氧化生成7-脱氧马钱苷酸，其Kmapp为25 μM；7-DLGT（UGT709C2）完成葡萄糖基化，Kmapp为9.8 μM；7-DLH（CYP72A224）催化7-脱氧马钱苷酸羟化生成马钱苷酸。研究对这些酶进行了体外生化表征，并在本氏烟草中同时表达8个途径基因、2个前体增强基因及下游的TDC和STR，成功异源重构了strictosidine的完整生物合成，这是首次在异源植物宿主中实现该途径的全长表达。完整解析途径意味着长春花中含量极低（约0.0002%鲜重）的抗癌单萜吲哚生物碱——长春碱和长春新碱，其前体供应不再受限于植物内源低产，为通过合成生物学手段在异源系统中规模化生产高价值生物碱奠定了基础。
创新点
鉴定了四个缺失酶（8-HGO、IO、7-DLGT、7-DLH），完整解析了seco-iridoid途径；首次在异源植物宿主中重构了strictosidine的完整生物合成。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | seco-iridoid pathway | 8-HGO (Caros003452) | 8-hydroxygeraniol oxidoreductase | 催化 | 以NAD+为辅因子，催化8-羟基香叶醇生成8-氧代香叶醛 |
| Saccharomyces cerevisiae | seco-iridoid pathway | CYP76A26 (IO) | iridoid oxidase | 催化 | 与ATR1共表达，催化iridodial/nepetalactol氧化生成7-脱氧马钱苷酸，Km=25 μM |
| Escherichia coli | seco-iridoid pathway | UGT709C2 (7-DLGT) | 7-deoxyloganic acid glucosyl transferase | 催化 | UDP-葡萄糖依赖，催化7-脱氧马钱苷酸糖基化，Km=9.8 μM |
| Saccharomyces cerevisiae | seco-iridoid pathway | CYP72A224 (7-DLH) | 7-deoxyloganic acid hydroxylase | 催化 | 催化7-脱氧马钱苷酸羟化为马钱苷酸，Km=400 μM |
| Nicotiana benthamiana | seco-iridoid pathway | G8O (CYP76B6) | geraniol 8-oxidase | 催化 | 催花香叶醇氧化为8-羟基香叶醇 |
| Nicotiana benthamiana | seco-iridoid pathway | IS | iridoid synthase | 催化 | 催化8-氧代香叶醛还原环化生成iridodial/nepetalactol |
| Nicotiana benthamiana | seco-iridoid pathway | LAMT | loganic acid O-methyltransferase | 催化 | 催化马钱苷酸甲酯化 |
| Nicotiana benthamiana | seco-iridoid pathway | SLS (CYP72A1) | secologanin synthase | 催化 | 催化马钱苷转化为断马钱苷 |
| Nicotiana benthamiana | monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis | TDC | tryptophan decarboxylase | 催化 | 催化色氨酸脱羧为色胺 |
| Nicotiana benthamiana | monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis | STR | strictosidine synthase | 催化 | 催化色胺与断马钱苷缩合为异胡豆苷 |
| Nicotiana benthamiana | terpenoid precursor biosynthesis | PaGPPS | geranyl diphosphate synthase | 催化 | 来自挪威云杉，增强前体GPP供应 |
| Nicotiana benthamiana | seco-iridoid pathway | VoGES | geraniol synthase | 催化 | 来自缬草，催化GPP生成香叶醇 |
| Catharanthus roseus | regulatory | ORCA2/ORCA3 | AP2-domain transcription factor | 调控 | 调控MIA途径基因表达 |
关键发现
- 鉴定了4个缺失酶：8-HGO以NAD+为辅因子，将8-羟基香叶醇氧化为8-氧代香叶醛
- IO（CYP76A26）催化iridodial/nepetalactol氧化生成7-脱氧马钱苷酸，Kmapp=25 μM，kcat=5.2 s-1
- 7-DLGT（UGT709C2）催化7-脱氧马钱苷酸葡萄糖基化，Kmapp=9.8 μM，kcat=1.25 s-1
- 7-DLH（CYP72A224）催化7-脱氧马钱苷酸羟化为马钱苷酸，Kmapp=400 μM，Vmax=0.01 pmol s-1 mg-1（微粒体蛋白）。在本氏烟草中同时表达8个途径基因、2个前体增强基因（PaGPPS和VoGES）及2个下游基因（TDC和STR），成功异源合成了strictosidine。长春花中长春碱和长春新碱的含量极低，仅约0.0002%鲜重。
研究结论
完整解析了长春花的seco-iridoid生物合成途径，鉴定了四个新酶，并在本氏烟草中成功重构了strictosidine的合成，证明该途径可应用于异源生产高价值单萜吲哚生物碱，为生物技术生产奠定了基础。