A genetic system to study Plasmodium falciparum protein function
- 作者
- Jakob Birnbaum, Sven Flemming, Nick Reichard, Alexandra Blanche Soares, Paolo Mesén-Ramírez, Ernst Jonscher, Bärbel Bergmann, Tobias Spielmann
- 杂志
- Nature Methods（2017）
- DOI
- 10.1038/nmeth.4223
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）中基因功能研究效率低、耗时，同源重组效率低且被动药物循环选择，尤其对必需基因的操作困难，导致蛋白定位和功能分析进展缓慢。
研究策略
开发基于选择连接的基因组整合（SLI）方法，利用跳过肽将无启动子的靶向序列与额外选择标记连接，通过单交换整合后表达抗性基因从而快速选择正确整合体；并结合 knock sideways (KS) 和 diCre 诱导系统，实现蛋白质水平的功能分析和条件性基因删除。
核心内容
该研究开发了一种基于选择连接的基因组整合（SLI）方法，用于恶性疟原虫的高效基因功能研究。该方法利用跳过肽将无启动子的靶向序列与选择标记连接，通过单交换整合后表达抗性基因，使正确整合体的筛选时间从传统方法的数月缩短至5到16天，共成功获得40个整合细胞系，平均耗时15.8天，而传统药物循环法对两个质粒长达3个月仍无法整合。研究将SLI与knock sideways和diCre诱导系统结合，实现了内源蛋白的GFP-FKBP标记、定位及条件性功能分析。通过对18个未知蛋白进行定位和筛选，14个成功定位，7个被鉴定为必需基因；HP1蛋白的误定位效率达95.8%。研究首次实现了Kelch13蛋白的定位（胞质点状结构）和功能分析，证实其C580Y突变显著提高青蒿素处理后的存活率，且双FKBP标签致其完全误定位后环状体期立即停滞。该工作为疟原虫及其他遗传操作困难的生物提供了一套快速、中高通量的蛋白功能研究工具。
创新点
1. 建立了SLI方法，将基因组整合筛选时间从数月缩短至5-16天；2. 实现内源蛋白C端/ N端GFP-FKBP标记，可同时定位蛋白和进行KS功能分析；3. 结合SLI-TGD快速鉴定必需基因；4. 首次实现Kelch13蛋白的定位和功能分析，并验证青蒿素抗性相关突变C580Y。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Plasmodium falciparum | 信号转导（裂殖子释放） | CDPK5 | CDPK5 | 催化 | 钙依赖蛋白激酶，通过SLI进行C端2xFKBP-GFP标记，KS显示导致裂殖体积累的逸出缺陷，验证为必需基因。 |
| Plasmodium falciparum | 表观遗传调控（异染色质形成） | HP1 | HP1 | 调控 | 异染色质蛋白1，核定位，KS效率95.8%，失活导致配子体积累，确认必需功能。 |
| Plasmodium falciparum | 内吞/内体运输 | rab5a | Rab5a | 调控 | 小GTP酶，N端GFP-2xFKBP标记，KS导致晚期裂殖体生长停滞，互补实验和diCre基因删除验证结果一致。 |
| Plasmodium falciparum | 内体成熟（Rab5/Rab7转换） | PF3D7_1352800 | Mon1 | 调控 | 含膜泡运输结构域的蛋白，定位于胞质斑点，KS显示对裂殖子发育重要，导致裂殖体期发育停滞。 |
| Plasmodium falciparum | 囊泡运输（ARF信号） | PF3D7_1244600 | ArfGAP | 调控 | GTP酶激活蛋白，定位于胞质斑点，KS显示对血期生长非必需。 |
| Plasmodium falciparum | 青蒿素耐药通路 | kelch13 | Kelch13 | 调控 | 青蒿素耐药相关蛋白，定位于胞质点状结构（近食物泡），SLI敲入C580Y突变赋予青蒿素耐药；条件性失活导致环状体期停滞，进而形成浓缩形态。 |
关键发现
- SLI在5-16天内获得正确整合的细胞系，总共产出40个整合细胞系，平均时间为15.8±5.0天；传统药物循环对两个质粒3个月未整合，两个需59天
- HP1的KS误定位效率为95.8%±3.7%（n=11）
- 对18个未知蛋白进行定位和KS筛选，14个成功定位，3个（候选11、13、15）被证明对生长重要，SLI-TGD显示7/18个靶标为必需
- Kelch13定位在胞质点状结构（靠近食物泡），通过SLI敲入Kelch13-C580Y突变显著提高青蒿素处理后存活率
- 双2xFKBP标签使Kelch13完全误定位，环状体期立即停滞，数天内逐渐变为浓缩形态。
研究结论
SLI是一种快速、稳健的基因组整合方法，与KS和diCre结合可进行中高通量的蛋白定位和功能分析，适用于恶性疟原虫及其他遗传操作困难的生物，并为研究青蒿素抗性蛋白Kelch13等关键蛋白提供了有力工具。