Improving 10-deacetylbaccatin III-10-β-O-acetyltransferase catalytic fitness for Taxol production
- 作者
- Bing-Juan Li, Hao Wang, Ting Gong, Jing-Jing Chen, Tian-Jiao Chen, Jin-Ling Yang, Ping Zhu
- 杂志
- Nature Communications（2017）
- DOI
- 10.1038/ncomms15544
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇在红豆杉中天然含量极低（约0.02%），而其类似物7-β-木糖基-10-脱乙酰紫杉醇（XDT）含量可高达0.5%，但10-脱乙酰巴卡亭III-10-β-O-乙酰转移酶（DBAT）对10-脱乙酰紫杉醇（DT）的催化效率远低于其天然底物10-DAB，导致难以利用丰富类似物XDT高效生产紫杉醇。
研究策略
对DBAT进行同源建模和分子对接，通过丙氨酸扫描和饱和突变进行半理性设计，筛选出对DT活性显著提高的双突变体DBATG38R/F301V，并与β-木糖苷酶LXYL-P1-2组合构建体外一锅反应体系，实现从XDT到紫杉醇的酶促转化。
核心内容
针对紫杉醇天然含量极低而丰富类似物7-β-木糖基-10-脱乙酰紫杉醇（XDT）难以直接利用的问题，本研究对10-脱乙酰巴卡亭III-10-β-O-乙酰转移酶（DBAT）进行了半理性改造，旨在提升其对非天然底物10-脱乙酰紫杉醇（DT）的催化活性。通过同源建模与分子对接解析DBAT结构，结合丙氨酸扫描和饱和突变，筛选获得双突变体DBATG38R/F301V。该突变体对DT的kcat/Km达3.54 M-1 s-1，较野生型（0.61 M-1 s-1）提高约6倍，比活为96.21×10-2 U/mg（相对活性370%），而对天然底物10-DAB的相对活性仍保留69.31%。进一步将该双突变体与β-木糖苷酶LXYL-P1-2组合，构建体外一锅双酶反应体系，在50 ml放大反应中15小时产出0.64 mg/ml紫杉醇。结果表明，半理性设计有效改善了DBAT对非天然底物的催化适应性，所构建的酶促转化路径为利用丰富类似物XDT环境友好地生产紫杉醇提供了可行方案。
创新点
首次构建了DBAT的三维结构模型并鉴定了关键活性位点；通过半理性设计获得了双突变体DBATG38R/F301V，其对DT的催化效率较野生型提高约6倍；构建了双酶一锅反应体系，在50 ml反应体积中15小时产出0.64 mg/ml紫杉醇。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成途径 | dbt（来自Taxus cuspidata等） | DBAT（10-脱乙酰巴卡亭III-10-β-O-乙酰转移酶） | 催化 | 野生型DBAT，用于乙酰化10-DAB和DT，但天然对DT活性极低 |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成途径 | dbt突变体（G38R/F301V） | DBATG38R/F301V | 催化 | 双突变体，对DT催化效率显著提高，用于一锅反应中乙酰化DT生成紫杉醇 |
| Pichia pastoris | 糖苷水解 | LXYL-P1-2 | LXYL-P1-2（β-木糖苷酶） | 催化 | 特异性水解XDT的7-β-木糖基，生成中间产物DT |
关键发现
- 野生型DBAT对DT的kcat/Km为0.61 M-1 s-1，双突变体DBATG38R/F301V为3.54 M-1 s-1（约提高6倍）
- 双突变体对DT的比活为96.21×10-2 U/mg（相对活性370%），对10-DAB相对活性69.31%
- 单突变G38R和F301V对DT的相对活性分别为218.77%和285%
- 一锅反应（1 ml）中紫杉醇产量达657 μg/ml，50 ml放大时达635 μg/ml（0.64 mg/ml）
- LXYL-P1-2对XDT的kcat/Km为9.7×103 M-1 s-1。
研究结论
通过半理性设计获得了对非天然底物DT高效催化的DBAT双突变体，结合LXYL-P1-2实现了从丰富类似物XDT到紫杉醇的体外一锅生物转化，为紫杉醇生产提供了环境友好的替代途径。