Emergence of terpene cyclization in Artemisia annua
- 作者
- Melissa Salmon, Caroline Laurendon, Maria Vardakou, Jitender Cheema, Marianne Defernez, Sol Green, Juan A. Faraldos, Paul E. O'Maillie
- 杂志
- Nature Communications（2015）
- DOI
- 10.1038/ncomms7143
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
揭示青蒿中萜烯环化功能在进化上如何出现，即环化机制从线性合酶（BFS）到环化合酶（ADS）的关键突变和上位性网络。
研究策略
以青蒿中产生线性(E)-β-farnesene的BFS和产生双环amorpha-4,11-diene的ADS为模型，通过结构引导的组合蛋白工程（SCOPE）将ADS中24个活性位点附近的自然氨基酸替换引入BFS，构建约27,000个突变体的基因文库，用GC-MS筛选环化活性，结合定点突变和动力学表征揭示关键突变及上位性网络。
核心内容
该研究以青蒿中产生线性(E)-β-farnesene的BFS与产生双环amorpha-4,11-diene的ADS为模型，利用结构引导的组合蛋白工程构建约27,000个突变体的基因文库，实际筛选754个突变体，结合定点突变和动力学表征探究萜烯环化功能的进化起源。结果显示，单一位点Y402L是激活环化的主导突变，可使约75%的酶催化产物转为15种环状萜烯，催化效率kcat/Km为5.9×10⁻³ μM⁻¹s⁻¹；V467G作为抑制突变使环化产物降至13%，Y430A则能解除其抑制，三突变体恢复至55%。进一步揭示残基402-467-430构成强上位性网络控制环化开关，该网络在Citrus junos BFS同源物中保守，其G467V突变可激活环化并产生53%环状产物。适应度景观分析显示青蒿网络粗糙度低于柑橘同源物，表明上位性强度因蛋白背景而异。该发现证明上位性网络是萜烯合酶中可迁移的模块化控制元件，为通过蛋白质工程精准设计萜烯环化活性提供了理论基础。
创新点
首次发现一个由残基402-467-430组成的强上位性网络控制青蒿BFS中萜烯环化的开启；证明单一位点Y402L是激活环化的主导突变，并可在Citrus junos BFS同源物中通过等价残基G467V激活环化；通过适应度景观分析量化了不同蛋白背景下上位性网络的差异。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | 萜类（倍半萜）生物合成 | BFS | (E)-β-farnesene synthase | 催化 | 野生型酶催化FPP生成线性(E)-β-farnesene，是环化的祖先背景。 |
| E. coli BL21(DE3) | 萜类（倍半萜）生物合成 | ADS | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化多步环化反应，生成双环前体amorpha-4,11-diene（青蒿素前体），作为环化功能的供体序列。 |
| E. coli BL21(DE3) | 萜类（倍半萜）生物合成 | BFS (Y402L) | BFS Y402L突变体 | 催化 | 单突变Y402L将线性合酶转变为环化酶，产生15种环状萜烯，占产物的75%。 |
| E. coli BL21(DE3) | 萜类（倍半萜）生物合成 | BFS (Y402L/V467G) | BFS Y402L/V467G突变体 | 催化 | V467G抑制Y402L的环化活性，导致产物主要为线性，环化比例降至13%。 |
| E. coli BL21(DE3) | 萜类（倍半萜）生物合成 | BFS (Y402L/V467G/Y430A) | BFS Y402L/V467G/Y430A突变体 | 催化 | Y430A克服V467G的抑制，恢复环化至55%。 |
| E. coli BL21(DE3) | 萜类（倍半萜）生物合成 | BFS (Y402L/Y430A) | BFS Y402L/Y430A突变体 | 催化 | 双突变产生高环化活性（87%），催化效率接近野生型。 |
| E. coli BL21(DE3) | 萜类（倍半萜）生物合成 | Citrus junos BFS | (E)-β-farnesene synthase同源物 | 催化 | 与A. annua BFS有51%同源性，其G467V突变可激活环化，产生15种环状萜烯，占总产物的53%。 |
关键发现
- 构建了理论27,524个突变体的BFS基因文库，实际筛选754个突变体
- 初始282个突变体中94%失活、5%保持野生型BFS活性、1%（3个）产生多种环状萜烯。单突变Y402L足以激活环化，产生15种环状萜烯，约占酶催化产物的75%（包括1.3%的推定的amorphane倍半萜），催化效率kcat/Km=5.9×10^-3 μM^-1s^-1（野生型BFS为10.5×10^-3）。V467G作为第二位点抑制突变，使Y402L/V467G双突变体的环化产物降至13%，催化效率约降低10倍（kcat/Km=0.8×10^-3）
- Y430A可克服V467G的抑制，Y402L/V467G/Y430A三突变体环化产物恢复至55%（kcat/Km=0.9×10^-3）
- Y402L/Y430A双突变体环化产物达87%，催化效率kcat/Km=7.1×10^-3。在整体突变集合中，加入Y402L使环状产物平均从4%升至58%（约15倍），而移除Y402L使环化消失
- V467G使环化从平均59%降至13%（4.5倍），移除V467G使环化从9%升至55%（6倍）。在Citrus junos BFS同源物中，G467V突变激活环化，产生15种环状萜烯，占总产物的53%，且催化效率kcat/Km=2.4 μM^-1s^-1（野生型为1.4）。适应度景观分析显示A. annua网络粗糙度r/s=0.571，而C. junos为0.871，表明后者上位性更强。
研究结论
青蒿中萜烯环化的出现由一个残基402-467-430组成的上位性网络控制，Y402L是激活环化的主导突变，V467G和Y430A分别起抑制和恢复环化的作用。这一网络在Citrus junos BFS同源物中保守但功能分配因蛋白背景而异，提示上位性网络是萜烯合酶折叠中可迁移的模块化控制元件，可用于蛋白质工程和合成生物学改造。