Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development
- 作者
- Chris J. Paddon, Jay D. Keasling
- 单位
- Amuris, Inc.; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Joint BioEnergy Institute
- 杂志
- Nature Reviews Microbiology（2014）
- DOI
- 10.1038/nrmicro3240
- 所属领域
- 合成生物学与代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决青蒿素供应不稳定、价格波动以及化学合成不经济的问题，通过微生物发酵生产青蒿素前体青蒿酸，再经化学转化合成半合成青蒿素，以稳定抗疟疾联合疗法的原料供应和价格。
研究策略
利用代谢工程和合成生物学技术，在大肠杆菌和酿酒酵母中异源表达甲羟戊酸途径及黄花蒿来源的青蒿素生物合成酶，生产青蒿酸，再通过有机化学方法将青蒿酸转化为青蒿素；采用设计-构建-测试-分析（DBTA）循环优化菌株和发酵工艺。
核心内容
该研究以半合成青蒿素为范例，展示了合成生物学在药物工业化生产中的应用路径。研究人员在大肠杆菌和酿酒酵母中异源重构甲羟戊酸途径并表达黄花蒿来源的青蒿素合成酶，通过设计-构建-测试-分析循环持续优化菌株与发酵工艺。在大肠杆菌中，组合使用TIGR调控方法平衡操纵子基因表达使甲羟戊酸产量提高7倍，替换HMG-CoA还原酶和合酶并采用氮碳限制补料分批发酵后，紫穗槐二烯产量达到25 g/L。随后将生产菌株转为酿酒酵母，通过过表达甲羟戊酸途径及细胞色素b5和脱氢酶，最终实现25 g/L青蒿酸，并利用肉豆蔻酸异丙酯覆盖层实现产物原位萃取与沉淀回收。青蒿酸再经非光化学工艺化学转化为与植物来源等价的青蒿素。该工作首次证明半合成青蒿素可在工业规模上经济可行地生产，稳定了抗疟疾联合疗法的原料供应，也为紫杉醇等其它天然产物药物的微生物制造提供了可迁移的工程策略。
创新点
['首次实现半合成青蒿素的工业规模生产，产品与植物来源青蒿素等价', '使用密码子优化的合成基因（如ADS）实现异源表达', '开发TIGR组合调控方法平衡操纵子基因表达，使甲羟戊酸产量提高7倍', '替换HMG-CoA还原酶和合酶（来自金黄色葡萄球菌）并优化发酵，使大肠杆菌中amorphadiene产量达到25 g/L', '将生产菌株从大肠杆菌转换为酿酒酵母，通过过表达甲羟戊酸途径及CYP71AV1、ADH1、ALDH1等，最终实现25 g/L青蒿酸', '应用亲脂性覆盖层（肉豆蔻酸异丙酯）实现青蒿酸的高效萃取与沉淀', '开发非光化学的青蒿酸转化为青蒿素的化学工艺']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（异源） | atoB, ERG13, tHMG1 | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、截短型HMG-CoA还原酶 | 催化 | 构成MevT操纵子（top pathway），将乙酰-CoA转化为甲羟戊酸 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（异源） | idi, ispA, MVD1, ERG8, ERG12 | 异戊烯基二磷酸异构酶、法尼基二磷酸合酶、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸激酶 | 催化 | 构成MevB操纵子（bottom pathway），将甲羟戊酸转化为FPP |
| Escherichia coli | 青蒿素前体生物合成 | ADS | 紫穗槐二烯合酶（amorphadiene synthase） | 催化 | 来自黄花蒿，密码子优化后表达，催化FPP转化为amorphadiene |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（异源） | mvaA, mvaS | II型HMG-CoA还原酶、HMG-CoA合酶 | 催化 | 来自金黄色葡萄球菌，替换酵母tHMG1和ERG13后显著提高amorphadiene产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径（内源增强） | ERG10, ERG13, tHMG1, ERG12, ERG8, MVD1, IDI1, ERG20 | 甲羟戊酸途径相关酶（乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶、异戊烯基二磷酸异构酶、法尼基二磷酸合酶） | 催化 | 过表达9个基因增强FPP合成，CEN.PK2菌株中amorphadiene产量达40 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素氧化途径 | CYP71AV1, CPR1, CYB5 | 细胞色素P450单加氧酶CYP71AV1、NADPH-细胞色素P450还原酶、细胞色素b5 | 催化 | 催化amorphadiene氧化为青蒿醇、青蒿醛进而生成青蒿酸；CPR1表达降低、CYB5表达提高可改善细胞活力并增加青蒿酸产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素氧化途径 | ADH1, ALDH1 | 青蒿醇脱氢酶、青蒿醛脱氢酶 | 催化 | 来自黄花蒿，分别催化青蒿醇氧化为青蒿醛、青蒿醛氧化为青蒿酸，二者共表达对达到25 g/L青蒿酸至关重要 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成分支 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 调控 | 通过CTR3启动子受铜离子抑制，减少角鲨烯合成，将碳通量导向amorphadiene/青蒿酸生产 |
| Saccharomyces cerevisiae | 全局调控 | GAL80 | Gal80p（半乳糖调控转录抑制因子） | 调控 | 删除GAL80使异源途径基因表达不依赖半乳糖诱导，降低发酵成本 |
| Saccharomyces cerevisiae | 全局调控 | UPC2-1 | UPC2（甾醇调控转录因子） | 调控 | 过表达UPC2-1在CEN.PK2菌株中导致乙酸盐积累和生长停滞，表明不同菌株背景对相同基因操作响应不同 |
关键发现
- 大肠杆菌表达酵母甲羟戊酸途径和密码子优化的ADS后，amorphadiene产量从112 mg/L提高到0.5 g/L，进一步通过替换tHMG1和ERG13为金黄色葡萄球菌的mvaA和mvaS，并结合氮碳限制补料分批发酵，达到25 g/L
- 酿酒酵母CEN.PK2菌株过表达甲羟戊酸途径后amorphadiene产量达40 g/L，但CYP71AV1表达导致氧化应激和细胞活力下降，通过表达黄花蒿细胞色素b5及ADH1、ALDH1，最终青蒿酸产量达到25 g/L
- TIGR优化使mevalonate产量提高7倍
- 采用CEN.PK2替代S288C使amorphadiene产量提高5倍
- 青蒿酸可通过添加肉豆蔻酸异丙酯沉淀回收，提取浓度达25 g/L且纯度较高。
研究结论
半合成青蒿素是利用合成生物学和代谢工程生产药物的首个成功范例，证明了该技术在工业规模上的可行性和经济性，为其他天然产物药物（如紫杉醇、吗啡前体等）的微生物生产提供了可借鉴的工程策略和方法。