Synthetic Biology and Metabolic Engineering Employing Escherichia coli for C2-C6 Bioalcohol Production
- 作者
- Liya Liang, Rongming Liu, Emily F. Freed, Carrie A. Eckert
- 单位
- Renewable and Sustainable Energy Institute, University of Colorado Boulder; National Renewable Energy Laboratory
- 杂志
- Frontiers in Bioengineering and Biotechnology（2020）
- DOI
- 10.3389/fbioe.2020.00710
- 所属领域
- 代谢工程 | 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用合成生物学和代谢工程手段改造大肠杆菌，提高C2-C6生物醇（乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、戊醇、异戊烯醇等）的产量、产率和耐受性，以推动工业化应用。
研究策略
综述近5年在大肠杆菌中生产C2-C6生物醇的代谢工程策略，包括共培养体系、温度诱导双相策略、CRISPR介导的基因组工程与RBS文库、代谢拨动开关、适应性实验室进化、生物传感器筛选、辅因子工程、路径优化及发酵工艺改进等。
核心内容
该研究系统综述了近年来利用合成生物学和代谢工程手段改造大肠杆菌生产C2-C6生物醇的研究进展，重点总结了多种提高产量、产率和耐受性的策略。文中涵盖了共培养体系、温度诱导双相发酵、CRISPR介导的基因组工程与RBS文库筛选、代谢拨动开关、适应性实验室进化、生物传感器辅助筛选、辅因子工程以及发酵工艺优化等多种技术手段。在关键结果方面，共培养体系以1:500比例利用葡萄糖和木糖时乙醇产量达46 g/L，产率0.49 g/L/h，达到理论产率的90%；异丁醇工程菌ED02产量为13.67 g/L，较亲本提高56.8%；经BmoR生物传感器筛选的异丁醇菌株在补料分批发酵中产量达56.5 g/L，产率0.533 g/L/h；异戊烯醇经IPP-bypass途径产量达10.8 g/L。此外，适应性进化使大肠杆菌的异丙醇耐受性提高至27 g/L，盐耐受菌株在离子液体存在下异戊烯醇产量较亲本提高6.6倍。这些结果表明，尽管C3-C6生物醇的产量和产率已显著提升，但距离工业化应用仍有差距，未来需要进一步开发非粮碳源利用、提高产物耐受性以及优化发酵工艺如原位产物移除等手段，以实现经济可行的生物醇生产。
创新点
总结了多种提高生物醇产量和耐受性的新技术：CRISPR介导的可追踪RBS文库（903个突变体）、代谢拨动开关（MTS）重定向TCA通量、双相-双温发酵策略、BmoR生物传感器筛选ARTP突变库、IPP-bypass甲羟戊酸途径、异源ED途径引入、适应性进化提高离子液体耐受等。
研究对象（23）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli LYglc1 (LY180衍生) | 乙醇发酵（葡萄糖） | xylR | XylR | 调控 | 删除xylR基因，使菌株仅能利用葡萄糖，用于共培养分解葡萄糖/木糖混合物 |
| Escherichia coli LYxyl3 (LY180衍生) | 乙醇发酵（木糖） | ptsG; galP; glk; xylR | PtsG; GalP; Glk; XylR* | 转运 | 敲除ptsG/galP/glk阻断葡萄糖转运，表达突变XylR*消除碳代谢物阻遏，使菌株仅利用木糖 |
| Escherichia coli (共培养体系) | 乙醇发酵 | pdc; adhA; adhE | Pdc; AdhA; AdhE | 催化 | 来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，用于乙醇合成 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 乙醇发酵 | ptsG; manZ; glk; pdc; adhB | PtsG; ManZ; Glk; Pdc; AdhB | 催化 | 温度诱导启动子控制ptsG表达，结合Z. mobilis的pdc/adhB，实现两相-两温发酵 |
| Escherichia coli BW25113 | 异丙醇合成 | thl; atoDA; adc; adh | Thl; AtoDA; Adc; Adh | 催化 | 异丙醇生物合成途径关键酶（硫解酶、乙酰乙酰CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶、醇脱氢酶） |
| Escherichia coli BW25113 | TCA循环/异丙醇 | gltA | GltA (柠檬酸合酶) | 催化 | 通过代谢拨动开关(MTS)调控gltA表达，重定向TCA通量至异丙醇生产 |
| Escherichia coli BW25113 | 丙酮酸代谢/异丙醇 | poxB; acs | PoxB; Acs | 催化 | 过表达丙酮酸氧化酶和乙酰辅酶A合成酶，将过量丙酮酸转化为乙酰-CoA |
| Escherichia coli (乙酸利用型) | 异丙醇合成 | nadK; acK; pta | NadK; Ack; Pta | 能量供给 | 过表达nadK增加NADH供应；更换ack-pta启动子增强乙酸利用，实现异丙醇产量1.47 g/L |
| Escherichia coli (ALE菌株) | 异丙醇耐受 | relA; marC; proQ; yfgO; rraA | RelA; MarC; ProQ; YfgO; RraA | 调控 | 适应性实验室进化鉴定的五个突变基因，将异丙醇耐受提高至27 g/L |
| Escherichia coli BW25113 | 异丙醇/丙酮耐受 | atoDA | AtoD; AtoA | 调控 | 敲除乙酰乙酰CoA转移酶基因atoDA，增强对500 mM异丙醇的耐受性 |
| Escherichia coli ED02 | 异丁醇合成 | — | — | 催化 | 引入异源Entner-Doudoroff途径（来自Z. mobilis）增强葡萄糖转化为丙酮酸，异丁醇产量13.67 g/L |
| Escherichia coli | 异丁醇合成 | alsS; ilvC; ilvD; kivd; adhA | AlsS; IlvC; IlvD; Kivd; AdhA | 催化 | 异丁醇途径酶，最佳摩尔比2.5:6.7:2:1.5:2，实现3 g/h/gDCW生产速率 |
| Escherichia coli | 乙酸同化/异丁醇 | acs; pckA; maeB | Acs; PckA; MaeB | 催化 | 过表达乙酰辅酶A合成酶和回补酶，以乙酸为唯一碳源提高异丁醇滴度26% |
| Escherichia coli (SSK42衍生) | 正丁醇合成（木糖） | hbd; crt; adhE2; ter; atoB | Hbd; Crt; AdhE2; Ter; AtoB | 催化 | 整合丁醇途径基因，以木糖为唯一碳源产丁醇4.3 g/L |
| Escherichia coli BL21衍生 | 正丁醇合成（甘油） | phaA; hbd; crt; ter; adhE2 | PhaA; Hbd; Crt; Ter; AdhE2 | 催化 | 从粗甘油产正丁醇6.9 g/L，通过基因敲除减少副产物 |
| Escherichia coli BL21衍生 | NADH再生/正丁醇 | aceEF; lpdA; zwf; pgl; udhA | AceEF; LpdA; Zwf; Pgl; UdhA | 能量供给 | 过表达NADH产生相关基因，提高辅因子供应，使正丁醇生产率提高5倍 |
| Escherichia coli (染色体工程菌) | 正丁醇合成 | fdh; phaA; hbd; crt; ter; adhE2 | Fdh; PhaA; Hbd; Crt; Ter; AdhE2 | 能量供给 | 整合甲酸脱氢酶(Fdh)增加NADH再生，经适应性进化和RBS优化，正丁醇产量20 g/L，达83%理论产率 |
| Escherichia coli (BW25113 ΔilvB ΔilvI ΔleuA) | 1-戊醇合成（酮酸延伸循环） | cimA; leuBCD; leuA; kivd; yqhD | CimA; LeuBCD; LeuA; Kivd; YqhD | 催化 | 表达柠檬酸合酶突变体CimAΔ2等，KivD V461突变提高对1-戊醇特异性，产量4.3 g/L |
| Escherichia coli XX03 | 异戊醇合成（异戊酰-CoA途径） | LiuC; AibAB; AibC; adhE2 | LiuC; AibAB; AibC; AdhE2 | 催化 | 来自黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)的异戊酰-CoA途径和丁酰-CoA还原酶，微氧条件下异戊醇产量80.5 mg/L |
| Escherichia coli DH1 (AK26) | 异戊烯醇合成（IPP-bypass甲羟戊酸途径） | atoB; HMGS; HMGR; MK; PMK; PMD | AtoB; HMGS; HMGR; MK; PMK; PMD | 催化 | 通过IPP-bypass途径，补料分批发酵异戊烯醇产量10.8 g/L，产率0.105 g/g |
| Escherichia coli | 异戊烯醇合成 | asnA; gldA; prpE | AsnA; GldA; PrpE | 调控 | CRISPRi多基因抑制天冬酰胺合成、甘油利用和丙酰-CoA合成，使异戊烯醇产量提高18-24% |
| Escherichia coli (离子液体适应菌株) | 异戊烯醇合成（纤维素水解液） | — | — | 调控 | 适应性进化提高对离子液体耐受，在离子液体存在下异戊烯醇产量1.06 g/L，较亲本高6.6倍；NaCl增强耐受性 |
| Escherichia coli (乙醇耐受菌株) | 乙醇耐受 | yajC | YajC | 转运 | 来自布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的yajC基因编码蛋白转位复合物亚基，提高对4%乙醇的耐受 |
关键发现
- 共培养LYglc1/LYxyl3以1:500比例时，乙醇产量46 g/L，产率0.49 g/L/h，达90%理论产率，糖利用率和乙醇产率分别提高50%和28%
- B0013-2021HPA菌株从260.9 g混合糖产乙醇127 g，产率4.06 g/L/h
- 异丙醇工程菌PA14产量7.1 g/L（24 h），产率0.75 mol/mol葡萄糖
- Soma等代谢拨动开关策略异丙醇产量3.8 g/L，为亲本4.4倍
- 以乙酸为碳源异丙醇产量1.47 g/L，产率0.56 g/g乙酸
- 异丁醇ED02产量13.67 g/L，产率0.456 g/L/h，较亲本提高56.8%和88.1%
- BmoR筛选的异丁醇菌株经补料分批发酵产量56.5 g/L，产率0.533 g/L/h
- 染色体工程菌产正丁醇20 g/L，达83%理论产率
- 利用粗甘油产正丁醇6.9 g/L，产率较对照提高5倍
- 1-戊醇产量4.3 g/L，占醇总量90%
- 异戊醇（经异戊酰-CoA途径）产量80.5 mg/L
- 异戊烯醇经IPP-bypass途径补料分批发酵产量10.8 g/L
- CRISPRi抑制asnA/gldA/prpE使异戊烯醇提高18-24%
- 盐耐受适应菌株在离子液体存在下异戊烯醇产量1.06 g/L，较亲本提高6.6倍
- 适应性进化使E. coli异丙醇耐受达27 g/L
- atoDA敲除使菌株能在500 mM异丙醇中生长。
研究结论
利用工程化大肠杆菌将可再生生物质转化为生物醇是化石燃料的可行替代方案。近年来C3-C6生物醇的滴度、产率和生产率已显著提升，但距工业化应用仍有差距。未来需开发非粮碳源利用、提高对抑制剂和产物耐受性、发展微生物联合体、优化发酵工艺（如原位产物移除），并借助CRISPR与系统生物学工具进一步优化代谢网络，以实现经济可行的生物醇生产。