Kauniolide synthase is a P450 with unusual hydroxylation and cyclization-elimination activity
- 作者
- Qing Liu, Arman Beyraghdar Kashkooli, David Manzano, Irini Pateraki, Lea Richard, Pim Kolkman, Maria Fatima Lucas, Victor Guallar, Ric C.H. de Vos, Maurice C.R. Franssen, Alexander van der Krol, Harro Bouwmeester
- 杂志
- Nature Communications（2018）
- DOI
- 10.1038/s41467-018-06565-8
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏催化愈创木内酯（guaianolide）生物合成中关键环化步骤的酶，阻碍了该类倍半萜内酯的代谢工程与合成生物学应用。
研究策略
通过转录组共表达分析筛选候选细胞色素P450，在酵母中异源表达和微体酶活测定鉴定kauniolide synthase，结合同源建模与分子对接阐明其独特催化机制，并在本氏烟草和酵母中重构完整生物合成通路。
核心内容
该研究鉴定出首个催化愈创木内酯生物合成的细胞色素P450酶——kauniolide synthase（TpKLS），并揭示了其独特的催化机制。研究人员通过转录组共表达分析筛选候选P450，在酵母中异源表达并利用微体酶活测定确认Tp8879可将costunolide转化为kauniolide，产物[M+H]+为231.1378，较底物减少2.015 D，表明发生脱氢环化。分子对接显示costunolide的C3与TpKLS血红素氧负离子距离3.6 Å，支持C3α-羟基化取向优先。该酶突破传统P450单加氧酶功能认知，同时具备羟基化、脱水、环化和去质子化多种活性。在酿酒酵母中表达TpGAS、TpGAO、CiCOS和TpKLS后，GC-MS在19.10 min处检测到与kauniolide标准品一致的峰；在本氏烟草中共表达相关基因也检测到kauniolide-cysteine加合物。该发现证明愈创木内酯生物合成无需独立环化酶，为相关通路的微生物与植物生产提供了新靶点。
创新点
['鉴定出首个催化愈创木内酯生物合成的P450酶——kauniolide synthase (TpKLS)', '发现该P450兼具羟基化、脱水、环化和去质子化多种催化活性，突破了传统P450单加氧酶的功能认知', '证明愈创木内酯生物合成无需独立环化酶，为相关通路工程化提供新靶点']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母WAT11菌株 | kauniolide生物合成（costunolide→kauniolide） | Tp8879 (TpKLS) | Kauniolide synthase (CYP71BZ6X) | 催化 | 在酵母微体酶活测定中催化costunolide生成kauniolide，并产生少量3β-羟基costunolide副产物 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | kauniolide生物合成 | Tp8879 (TpKLS) | Kauniolide synthase (CYP71BZ6X) | 催化 | 与上游基因共表达后检测到kauniolide-cysteine加合物，验证in planta功能 |
| 酿酒酵母WAT11菌株 | 倍半萜内酯生物合成（germacrene A合成） | TpGAS | Germacrene A synthase | 催化 | 参与酵母中kauniolide通路重构，催化FPP环化生成germacrene A |
| 酿酒酵母WAT11菌株 | 倍半萜内酯生物合成（germacrene A氧化） | TpGAO | Germacrene A oxidase | 催化 | 参与酵母中kauniolide通路重构，催化germacrene A氧化为germacrene A酸 |
| 酿酒酵母WAT11菌株 | 倍半萜内酯生物合成（costunolide合成） | CiCOS | Costunolide synthase | 催化 | 参与酵母中kauniolide通路重构，催化germacrene A酸环化为costunolide |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 甲羟戊酸途径（前体供给） | AtHMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 过表达以增强FPP供给，提高倍半萜内酯产量 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 倍半萜内酯生物合成（costunolide合成） | TpGAS, TpGAO, CiCOS | Germacrene A synthase, Germacrene A oxidase, Costunolide synthase | 催化 | 与TpKLS共表达实现kauniolide通路的烟草瞬时重构 |
关键发现
['Tp8879 (TpKLS) 催化costunolide环化生成kauniolide，反应产物中kauniolide-cysteine峰强度是3β-羟基costunolide-cysteine的6.7倍', '在酵母微体酶活测定中，TpKLS催化costunolide产生的产物[M+H]+=231.1378，比底物少2.015 D，表明发生脱氢环化', '分子对接显示costunolide的C3与TpKLS血红素氧负离子距离为3.6 Å，氢原子提取坐标约2.2 Å，且α-羟基化取向优于β-取向', '在酿酒酵母中表达TpGAS、TpGAO、TpCOS和TpKLS后，GC-MS在保留时间19.10 min处检测到与kauniolide标准品一致的峰', '在本氏烟草中短暂共表达AtHMGR、TpGAS、TpGAO、TpCOS和TpKLS后，检测到kauniolide-cysteine加合物([M+H]+=352.1577)']
研究结论
本文鉴定并表征了kauniolide synthase（TpKLS），一种催化costunolide转化为kauniolide的细胞色素P450，该酶通过独特的C3α-羟基化-脱水-环化-去质子化机制完成反应。在烟草和酵母中成功重建kauniolide生物合成通路，为愈创木内酯类化合物的微生物和植物生产奠定了基础。