COMPASS for rapid combinatorial optimization of biochemical pathways based on artificial transcription factors
- 作者
- Gita Naseri, Jessica Behrend, Lisa Rieper, Bernd Mueller-Roeber
- 杂志
- Nature Communications（2019）
- DOI
- 10.1038/s41467-019-10224-x
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何快速实现多基因生物合成途径的平衡表达与组合优化，降低构建和筛选成本。
研究策略
利用植物源人工转录因子（ATF）和同源重组，开发高通量组合克隆方法COMPASS，结合CRISPR/Cas9多基因座整合与正筛选，构建大型表达文库并优化代谢途径。
研究路线图
核心内容
研究者开发了一种名为COMPASS的组合优化方法，旨在快速实现多基因生物合成途径的平衡表达。该方法利用植物源人工转录因子构建可诱导的多基因调控系统，仅需11个核心载体即可完成十基因途径的组合组装，并结合CRISPR/Cas9实现多基因座一步整合与正筛选，显著降低克隆验证成本。在酿酒酵母中，COMPASS成功应用于β-胡萝卜素、β-紫罗酮及柚皮素的生产优化，其中β-胡萝卜素最高产量达0.81 mg/g cdw，较组成型启动子对照提高约1.2–1.5倍；β-紫罗酮最高产量为0.18 mg/g cdw，比参考菌株高4.2倍。可诱导系统使诱导后β-胡萝卜素产量提升8.5倍，且未诱导时菌株生长速率与野生型相当，实现了生长与生产阶段的解偶联。仅检测0.0000025%的文库复杂度即筛选出高产菌株，表明COMPASS是一种高效、通用的多基因途径优化工具，可大幅降低构建与筛选成本，适用于合成生物学和代谢工程的多种应用场景。
创新点
['开发了基于植物源人工转录因子的可诱导多基因调控系统', '仅需11个核心载体即可实现十基因途径的组合组装', '引入正筛选策略，显著减少克隆验证工作', '支持CRISPR/Cas9介导的多基因座一步整合', '实现生长与生产阶段解偶联，减少代谢负担']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | β-胡萝卜素生物合成 | MrtI (McrtI) | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自红发夫酵母，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-胡萝卜素生物合成 | BTS1 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 酵母内源GGPP合酶，提供类胡萝卜素前体 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-胡萝卜素生物合成 | MrtYB (McrtYB) | 双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶 | 催化 | 来自红发夫酵母，催化两分子GGPP生成八氢番茄红素并进一步环化 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-紫罗酮生物合成 | RiCCD1 | 类胡萝卜素裂解双加氧酶 | 催化 | 来自植物，催化β-胡萝卜素裂解生成β-紫罗酮 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-紫罗酮生物合成 | GGPPSbc | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 作为BTS1的替代酶，用于改善GGPP供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 柚皮素生物合成 | AtC4H:L5:AtATR2 | 肉桂酸4-羟化酶融合细胞色素P450还原酶 | 催化 | 拟南芥来源，催化肉桂酸对羟基化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 柚皮素生物合成 | PhCHI | 查尔酮异构酶 | 催化 | 催化查尔酮异构化生成柚皮素 |
| Saccharomyces cerevisiae | 柚皮素生物合成 | HaCHS | 查尔酮合酶 | 催化 | 催化丙二酰辅酶A和香豆酰辅酶A缩合生成查尔酮 |
| Saccharomyces cerevisiae | 柚皮素生物合成 | At4CL-2 | 4-香豆酸辅酶A连接酶 | 催化 | 拟南芥来源，催化香豆酸生成香豆酰辅酶A |
| Saccharomyces cerevisiae | 柚皮素生物合成 | AtPAL-2 | 苯丙氨酸解氨酶 | 催化 | 拟南芥来源，催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多基因表达调控 | — | 植物源人工转录因子（如NLS-GAL4AD-ATAF1/2x等9种） | 调控 | IPTG诱导，结合特定结合位点，强度可调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 柚皮素检测 | fdeR | FdeR转录因子 | 调控 | 柚皮素响应生物传感器效应器，激活yEGFP表达 |
关键发现
- COMPASS成功用于β-胡萝卜素、β-紫罗酮及柚皮素生产优化。β-胡萝卜素最高产量达0.81±0.25 mg/g cdw（菌株G1pDI 1），较TDH3组成型启动子对照提高1.2-1.5倍
- β-紫罗酮最高产量0.18±0.015 mg/g cdw（菌株Narion 14），比参考菌株RiCCD1高4.2倍。可诱导ATF系统使诱导后β-胡萝卜素产量提高8.5倍，且未诱导时菌株生长速率与野生型相当，诱导后生长速率下降7-16%。通过检测0.0000025%的文库复杂度即筛选出高产菌株。
研究结论
COMPASS是一种高效、通用的多基因途径组合优化工具，利用植物源可诱导人工转录因子实现基因表达的精细平衡，并显著降低构建和筛选成本，适用于合成生物学和代谢工程中的多种应用。