高级醇 · 代谢工程文献库

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Towards a comprehensive understanding of the structural dynamics of a bacterial diterpene synthase during catalysis

作者
Ronja Driller, Sophie Janke, Monika Fuchs, Evelyn Warner, Anil R. Mhashal, Dan Thomas Major, Mathias Christmann, Thomas Brück, Bernhard Loll
单位
Institute of Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin; Institute of Pharmacy, Freie Universität Berlin; Werner Siemens-Chair of Synthetic Biotechnology, Technical University of Munich; Department of Chemistry and Institute for Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University; Institute of Biochemistry, University of Greifswald
杂志
Nature Communications（2018）
DOI
10.1038/s41467-018-06325-8
所属领域
合成生物学
关键词
CotB2catalysiscrystallographyditerpene synthasemolecular dynamicsstructural dynamicsterpene synthase
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解决的核心问题

揭示细菌二萜合酶CotB2在催化过程中蛋白质结构的动态变化以及酶与底物/中间体的相互作用机制

研究策略

结合X射线晶体学捕获催化过程中多个状态的结构（包括与底物类似物FGGDP共结晶捕获环化中间体F-Dola），辅以生化活性实验和多尺度分子动力学(QM/MM)模拟，阐明CotB2的完整催化机理

研究路线图

100%
研究问题：CotB2催化过程中蛋白结构动态与底物作用机制
策略：晶体学捕获各催化状态+生化实验+QM/MM模拟
关键改造1：与FGGDP共结晶捕获中间体F-Dola（1.8Å封闭态）
关键改造2：C-末端12残基折叠封闭活性位点（ΔC突变失活）
关键改造3：阐明WXXXXXRY保守基序与碳正离子稳定机制
结果：捕获F-Dola；C-末端封闭机制；W186π-阳离子稳定；氧洞稳定中间体B
结果：酶稳定化能-10~-20 kcal/mol；突变体产物谱分析证实机制
结论：CotB2通过C-末端关闭+活性位点精准稳定中间体引导环化，为萜类工程奠定基础
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核心内容

该研究通过X射线晶体学、生化实验与QM/MM分子动力学模拟相结合，系统解析了细菌二萜合酶CotB2催化过程中的结构动态变化。研究者利用底物类似物FGGDP与CotB2共结晶，获得1.8Å分辨率的封闭态结构，首次在晶体中捕获到环化中间体F-Dola及游离焦磷酸。实验发现，C-末端12个残基缺失突变体完全失活，表明该区域折叠封闭活性位点对催化至关重要。催化机制上，Mg²⁺B先与NSE基序结合，底物结合诱导D111-R294盐桥形成，随后Mg²⁺A和Mg²⁺C结合促使螺旋D移动，活性位点体积减小；关键碳正离子中间体分别通过π-阳离子作用与W186、由N103和T106形成的氧洞、以及F107/F149的疏水夹持得以稳定，酶对中间体的稳定化能约为-10至-20 kcal/mol。突变实验显示F107A和W288G分别改变产物谱为cembrene A和3,7,18-dolabellatriene。该研究阐明了CotB2通过精确稳定各碳正离子中间体引导环化反应走向cyclooctat-9-en-7-ol的完整机理，为萜类合酶的理性工程改造提供了结构基础。

创新点

首次在晶体中捕获到二萜合酶催化环化反应产生的中间体（F-Dola）；揭示了C-末端12个残基折叠封闭活性位点对催化至关重要的机制；提出了WXXXXXRY保守基序；结合结构证据建立了CotB2完整催化循环的构象变化模型

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli Rosetta2 (DE3) 二萜生物合成 cotB2 CotB2 催化 野生型，催化GGDP环化为cyclooctat-9-en-7-ol
Escherichia coli Rosetta2 (DE3) 二萜生物合成 cotB2 (F107A) CotB2F107A 催化 点突变，产物变为cembrene A，用于结构捕获Mg2+B结合状态
Escherichia coli Rosetta2 (DE3) 二萜生物合成 cotB2 (W288G) CotB2W288G 催化 点突变，产物变为3,7,18-dolabellatriene
Escherichia coli Rosetta2 (DE3) 二萜生物合成 cotB2 (W288F) CotB2W288F 催化 点突变，活性降低但产物谱不变
Escherichia coli Rosetta2 (DE3) 二萜生物合成 cotB2 (D111E) CotB2D111E 催化 点突变，完全失活，破坏盐桥
Escherichia coli Rosetta2 (DE3) 二萜生物合成 cotB2 (ΔCter) CotB2ΔCter 催化 C-末端12个残基截短，完全失活

关键发现

  1. CotB2与底物类似物FGGDP共结晶得到1.8Å分辨率的封闭态结构，捕获了环化中间体2-fluoro-3,7,18-dolabellatriene（F-Dola）和游离焦磷酸
  2. C-末端12个残基缺失突变体CotB2ΔC完全失活（GC/MS检测不到产物）
  3. Mg2+B与NSE基序结合是第一步，随后底物结合诱导D111-R294盐桥形成，Mg2+A和Mg2+C结合导致螺旋D移动和活性位点体积减小
  4. C-末端折叠形成氢键网络封闭活性位点
  5. QM/MM模拟显示初始预折叠态GGDP的C1-C11距离为3.9Å，C10-C14距离为3.3Å
  6. 碳正离子中间体A通过π-阳离子作用与W186稳定（距离4.6Å），中间体B由N103(OD1)、N103(O)和T106(OG1)形成的氧洞稳定，中间体C夹在F107和F149之间
  7. 酶对碳正离子的稳定化能约-10至-20 kcal/mol
  8. W288F突变降低活性但产物谱不变，F107A突变的产物为cembrene A，W288G突变的产物为3,7,18-dolabellatriene

研究结论

CotB2通过C-末端折叠关闭活性位点，并利用活性位点氨基酸精确地稳定沿反应坐标产生的各个碳正离子中间体，从而引导环化反应走向最终产物cyclooctat-9-en-7-ol；该机制为理性工程改造萜类合酶奠定了基础