高级醇 · 代谢工程文献库

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Synthetic biology based construction of biological activity-related library of fungal decalin-containing diterpenoid pyrones

作者
Kento Tsukada, Shono Shinki, Akihao Kaneko, Kazuma Murakami, Kazuhiro Irie, Masatoshi Murai, Hideto Miyoshi, Shingo Dan, Kumi Kawaji, Hironori Hayashi, Eiichi N. Kodama, Aki Hori, Emil Salim, Takayuki Kuraishi, Naoya Hirata, Yasunari Kanda, Teigo Asai
杂志
Nature Communications（2020）
DOI
10.1038/s41467-020-15664-4
所属领域
合成生物学
关键词
Aspergillus oryzaecombinatorial biosynthesisdecalin-containing diterpenoid pyronesgenome miningheterologous biosynthesissynthetic biology
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解决的核心问题

如何快速、合理地扩大具有生物活性的真菌脱羧二萜吡喃酮（DDPs）的化学空间，并为其药物发现提供可靠、充足的化合物来源。

研究策略

采用基于异源生物合成与基因组挖掘相结合的合成生物学方法，在米曲霉（Aspergillus oryzae）中重构五种天然DDP生物合成途径，并通过组合生物合成设计延伸途径和旁路途径，构建DDP聚焦文库。

研究路线图

研究问题：
如何扩展真菌DDPs化学空间
并保证药物发现来源
研究策略：
异源生物合成＋基因组挖掘，
米曲霉中重构天然DDP途径
关键改造一：
重构5个真菌属DDP生物合成基因簇
（米曲霉NSAR1异源表达）
关键改造二：
设计4条延伸途径＋1条旁路途径，
引入非天然修饰酶（MT/P450/SDR）
关键改造三：
异源重组生产22种DDPs
（15个新化合物；产量5–89 mg/L）
结果一：
22种DDPs（15个全新），
关键产量：subglutinol A达89 mg/L
结果二：
新DDPs活性多样：
抑制线粒体复合体III（IC50=12 nM）、
抗HIV（EC50=8.5 nM）、
抗乳腺癌干细胞（1 μM显著）、
抑制Aβ42聚集
结论：
合成生物学有效扩展天然产物空间，
组合生物合成产出独特活性类似物，
为药物发现提供化合物库和可靠来源
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核心内容

该研究以合成生物学手段系统拓展了真菌脱羧二萜吡喃酮（DDP）类天然产物的化学空间。作者在米曲霉中异源重构了来自五个真菌属的五条天然DDP生物合成基因簇，并通过组合生物合成策略设计了四条非天然延伸途径和一条旁路途径，实现对核心骨架的系统修饰。最终共产出22种DDP化合物，其中15种为新结构。关键中间体4产量达87 mg/L，subglutinol A产量为89 mg/L，为后续活性研究提供了充足材料。活性评价揭示了多种强效生物活性：subglutinol A及化合物21对DL1细胞IC50分别为12 nM和15 nM，化合物20兼具高效抗HIV活性（EC50=8.5 nM）和低细胞毒性（CC50>10,000 nM），化合物12可显著降低乳腺癌干细胞群体，化合物21还能以0.27 μM的IC50抑制IMD免疫通路。这些结果证明组合生物合成能有效创造结构新颖且功能多样的DDP类似物，为药物发现提供了宝贵的化合物库与可靠的异源供应途径。

创新点

首次全面重构了五个真菌属的DDP生物合成基因簇；设计了四条非天然延伸途径和一条旁路途径；通过异源重组生产了22种DDPs，其中15种为新化合物；首次发现DDPs具有多种强效生物活性，如抑制线粒体复合体III、抗癌干细胞、抗HIV、抑制Aβ聚集等。

研究对象（19）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpasA DpasA 催化 非还原性聚酮合酶（NR-PKS），催化α-吡喃酮polyketide链合成
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpasC DpasC 催化 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPPS），提供二萜前体
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpasD DpasD 催化 异戊烯基转移酶（PT），催化异戊烯基转移至α-吡喃酮
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpasB DpasB 催化 FAD依赖性环氧化酶（FMOep），参与萜烯环化前修饰
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpasE DpasE 催化 萜环化酶（TC），催化decalin环系形成
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpasF DpasF 催化 FMO氧化酶，催化C5单元THF环形成及多步氧化（如生成enone）
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpmaF DpmaF 催化 FAD依赖性BBE结构域氧化还原酶，催化C5单元THF环形成
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpchF DpchF 催化 FMO氧化酶，参与C5单元修饰生成higginsianin A
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpchG DpchG 催化 短链脱氢还原酶（SDR1），催化C-8羟基氧化为酮
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpchH DpchH 催化 短链脱氢还原酶（SDR2），催化C-8酮还原为8R羟基（立体翻转）
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpmpG DpmpG 催化 SDR1，氧化8S羟基为酮
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpmpH DpmpH 催化 SDR2，还原酮为8R羟基
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpmpI DpmpI 催化 甲基转移酶（MT1），催化C-27甲基化（γ-吡喃酮甲酯形成）
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpmpJ DpmpJ 催化 细胞色素P450，催化C-26甲基氧化为伯醇
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpfgG DpfgG 催化 SDR1，催化C-8羟基氧化
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpfgH DpfgH 催化 SDR2，催化C-8酮还原
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpfgI DpfgI 催化 甲基转移酶（MT1），催化甲基化；同时具有C-26羟基化活性
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpfgJ DpfgJ 催化 细胞色素P450，催化C-27三步氧化生成羧酸，并氧化C-26
Aspergillus oryzae NSAR1 decalin-containing diterpenoid pyrone (DDP) biosynthesis dpfgK DpfgK 催化 甲基转移酶（MT2），催化羧酸甲酯化

关键发现

  1. 在米曲霉中重构5条天然途径、1条旁路途径和4条延伸途径，共产出22种DDPs（含15个新化合物）。关键产量：中间体4为87 mg/L，subglutinol A（5）为89 mg/L，higginsianin A（10）为28 mg/L，新化合物12为21 mg/L，13为5 mg/L，14为2 mg/L，17为5 mg/L，18为3 mg/L，19为16 mg/L，20为5 mg/L，21为6 mg/L。生物活性：subglutinol A（5）对DL1细胞IC50=12 nM，化合物21对DL1细胞IC50=15 nM
  2. 化合物20抗HIV活性EC50=8.5 nM（CC50>10,000 nM）
  3. 化合物12在1 μM时显著降低ALDH阳性乳腺癌干细胞群
  4. 化合物21抑制IMD固有免疫通路IC50=0.27±0.01 μM
  5. 化合物13和21延迟Aβ42成核相至6 h和13 h。

研究结论

合成生物学方法能够有效扩展天然产物化学空间，组合生物合成产生的新类似物具有独特且多样的生物活性，为药物发现提供了宝贵的化合物文库和可靠的供应途径。

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