A cell-free platform for the prenylation of natural products and application to cannabinoid production
- 作者
- Meaghan A. Valliere, Tyler P. Korman, Nicholas B. Woodall, Gregory A. Khitrov, Robert E. Taylor, David Baker, James U. Bowie
- 单位
- University of California, Los Angeles; University of California, Los Angeles; University of California, Los Angeles; University of California, Los Angeles; University of California, Los Angeles; University of California, Los Angeles; University of California, Los Angeles
- 杂志
- Nature Communications（2019）
- DOI
- 10.1038/s41467-019-08448-y
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
天然产物异戊烯基化修饰产物丰度低、难以提取，化学合成复杂度高且产率低；微生物代谢工程受限于产物毒性、中间体毒性、底物不可透性及复杂次级代谢途径的调控，难以实现异戊烯基化天然产物（尤其是大麻素）的高效生物合成。
研究策略
开发基于葡萄糖为底物的无细胞酶促异戊烯基化平台（合成生物化学），利用改造的糖酵解途径与甲羟戊酸途径在体外生成异戊烯基焦磷酸（GPP/DMAPP），结合芳香族异戊烯基转移酶对底物进行异戊烯基化，并通过蛋白质工程改造NphB提高对大麻素前体橄榄醇酸的特异性与活性。
核心内容
该研究构建了一个以葡萄糖为底物的无细胞酶促异戊烯基化平台，用于高效合成大麻素等多种异戊烯基化天然产物。通过在体外整合改造的糖酵解、甲羟戊酸途径及芳香族异戊烯基转移酶，实现异戊烯基焦磷酸的原位生成与底物修饰，并引入丙酮酸氧化酶/磷酸转乙酰酶旁路以规避芳香底物对丙酮酸脱氢酶的抑制。利用Rosetta计算设计改造NphB，获得高活性突变体M23和M31，其kcat较野生型提高约1000倍。结合非烷流动萃取原位移除产物，CBGA产量从野生型的132 mg/L提升至1.25 g/L，总提升约140倍；以M31生产CBGVA的最终效价达1.74 g/L，并首次实现CBGVA向CBDVA的酶促转化。该平台避免了细胞毒性、底物不可透性和通路调控复杂等限制，为异戊烯基化天然产物及大麻素的灵活高效合成提供了微生物代谢工程之外的有效替代方案。
创新点
['建立以葡萄糖为原料的无细胞异戊烯基化通用平台，可生产多种异戊烯基黄酮、异戊烯基二苯乙烯类和大麻素类化合物', '引入PDH旁路（PyOx/PTA），避免了芳香底物对PDH的抑制', '利用Rosetta计算设计改造NphB，获得高活性、高特异性的CBGA合酶突变体M23和M31，kcat提高约1000倍', '利用非烷流动萃取系统原位去除产物CBGA，减轻酶沉淀，提高CBGA产量', '首次实现CBGVA向罕见大麻素CBDVA的酶促转化']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 无细胞系统（体外酶促体系） | 糖酵解途径（modified glycolysis） | — | 己糖激酶、磷酸果糖激酶等同工酶 | 能量供给 | 葡萄糖分解为丙酮酸，提供ATP和NADPH |
| 无细胞系统（体外酶促体系） | PDH旁路（丙酮酸氧化酶/磷酸转乙酰酶） | pyOx, pta | 丙酮酸氧化酶（PyOx）、磷酸转乙酰酶（PTA） | 催化 | 替代丙酮酸脱氢酶复合体，避免芳香底物抑制 |
| 无细胞系统（体外酶促体系） | 甲羟戊酸途径（mevalonate pathway） | — | 甲羟戊酸途径各酶 | 催化 | 由乙酰-CoA合成GPP，共8步酶催化 |
| 无细胞系统（体外酶促体系） | 异戊烯基化模块 | nphB | NphB（芳香族异戊烯基转移酶） | 催化 | 野生型可异戊烯基化1,6-DHN、橄榄醇、橄榄醇酸等；经工程改造获得M23和M31突变体 |
| 无细胞系统（体外酶促体系） | 异戊烯基化模块 | ataPT | AtaPT（芳香族异戊烯基转移酶） | 催化 | 广谱底物异戊烯基转移酶，用于生产多种异戊烯基产物 |
| 无细胞系统（体外酶促体系） | 异戊烯基化模块 | novQ | NovQ（异戊烯基转移酶） | 催化 | 可将二甲基烯丙基加到苯丙烷类和黄酮类化合物 |
| 毕赤酵母（Pichia pastoris X33） | 大麻素后修饰途径 | CBDAS | 大麻二酚酸合酶（CBDA synthase） | 催化 | 催化CBGA→CBDA，CBGVA→CBDVA；无细胞表达获得 |
| 无细胞系统（体外酶促体系） | 大麻素生物合成 | nphB（M23/M31） | 工程化NphB突变体（M23, M31） | 催化 | M23高效特异合成CBGA；M31高效合成CBGVA，催化效率比M23高15倍，比WT高650倍 |
| 无细胞系统（体外酶促体系） | 还原力调控 | — | 分子 purge valve（分子排气阀） | 调控 | 平衡NADPH产生与消耗，维持碳通量 |
| 无细胞系统（体外酶促体系） | 产物原位萃取 | — | — | 区室化 | 非烷流动系统将CBGA从反应器转移至缓冲液储库，降低酶沉淀 |
关键发现
- PDH旁路系统使5-异戊烯基-1,6-二羟基萘产量提高4倍，达705±12 mg/L
- 野生型NphB初始CBGA产量仅132 mg/L，prenylation速率2.1 mg L⁻¹ h⁻¹
- 工程酶M23/M31的kcat比野生型高约1000倍，CBGA产量达744±34 mg/L（比野生型高21倍，速率快100倍）
- 采用非烷流动萃取后CBGA产量达1.25±0.07 g/L
- 以M31生产CBGVA最大速率约107 mg L⁻¹ h⁻¹，最终效价1.74±0.09 g/L，转化92%的底物
- CBDA合成酶将CBGA转化为CBDA的速率为14.4±0.8 mg L⁻¹ h⁻¹ mg总蛋白⁻¹，4天内转化25%
- CBGVA转化为CBDVA的速率为7.1±0.1 mg L⁻¹ h⁻¹ mg总蛋白⁻¹
- 初始CBGA仅为9 mg/L，经PDH旁路优化至132 mg/L，再经酶工程提升至600 mg/L，最终经产物移除提升至1.25 g/L，总提升约140倍。
研究结论
无细胞酶促平台可高效、灵活地生产多种异戊烯基化天然产物，尤其是大麻素前体CBGA和CBGVA，并通过一步酶转化生成CBDA和CBDVA。该方法避免了细胞毒性、底物不可透性和通路复杂性等限制，展示了合成生物化学作为微生物代谢工程替代方案的潜力。