Hydrophobic recognition allows the glycosyltransferase UGT76G1 to catalyze its substrate in two orientations
- 作者
- Ting Yang, Jinzhu Zhang, Dan Ke, Wenxian Yang, Minghai Tang, Jian Jiang, Guo Cheng, Jianshu Li, Wei Cheng, Yuquan Wei, Qintong Li, James H. Naismith, Xiaofeng Zhu
- 杂志
- Nature Communications（2019）
- DOI
- 10.1038/s41467-019-11154-4
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析糖基转移酶UGT76G1如何通过疏水相互作用实现底物识别，并解释其能在同一活性位点以两种不同取向催化甜菊糖苷底物发生β(1-3)糖基化的结构基础。
研究策略
通过多种复合物晶体结构（UGT76G1与UDP、UDP+Reb A、UDP+Rubu等）结合生化活性测定、动力学分析和分子建模，揭示UGT76G1利用疏水作用而非经典氢键网络进行底物识别的机制。
研究路线图
核心内容
该研究解析了糖基转移酶UGT76G1催化甜菊糖苷底物发生β(1-3)糖基化的结构基础，揭示了其独特的底物识别机制。研究者通过获取UGT76G1与UDP、UDP+Reb A、UDP+Rubu等配体的多种复合物晶体结构，结合生化活性测定和分子建模，发现该酶依赖疏水相互作用而非经典氢键网络识别底物。结构显示，二萜骨架由Leu85、Met88、Ile90等残基构成的疏水口袋包围，仅葡萄糖A与His25形成一个氢键。这种非定向的疏水识别允许底物在活性位点以两种不同取向结合，实现R1和R2双位点的糖基化。动力学分析表明，UDPG的Km为5.6±0.4 μM，STB的Km为4.8±0.4 μM；H25A突变体kcat降至野生型的10⁻⁵，H25N则完全失活，证实His25为催化关键残基。此外，4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷可作为底物被糖基化，表明疏水芳环能替代甜菊醇骨架。该发现为理解糖基转移酶的双端催化机制提供了新模型，也为甜菊糖苷类甜味剂（如Reb D和Reb M）的高效生物合成及酶的理性工程改造奠定了理论基础。
创新点
首次发现UGT76G1通过疏水相互作用（而非氢键）识别底物，允许底物在活性位点以两种不同方向结合，实现R1和R2双位点的β(1-3)糖基化；提出了'翻转结合'模型解释双端催化现象；证明疏水基团（如4-硝基苯基）可替代二萜骨架作为识别柄，为糖基转移酶工程改造提供新思路。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 甜菊糖苷生物合成 | UGT76G1 | UGT76G1（UDP-葡萄糖依赖性糖基转移酶，GT-B折叠） | 催化 | 催化β(1-3)葡萄糖加至甜菊糖苷R1和R2位点的葡萄糖A上，通过疏水识别底物，可采取两种结合取向。 |
| — | 甜菊糖苷生物合成 | UGT85C2 | UGT85C2 | 催化 | 在C13-羟基（R1位点）添加第一个葡萄糖。 |
| — | 甜菊糖苷生物合成 | UGT74G1 | UGT74G1 | 催化 | 在C19-羧基（R2位点）添加第一个葡萄糖。 |
| — | 甜菊糖苷生物合成 | UGT91D2 | UGT91D2 | 催化 | 在葡萄糖A上添加β(1-2)葡萄糖，生成二糖。 |
| — | 甜菊糖苷生物合成 | — | UGT76G1的His25和Asp124催化二元体 | 催化 | His25作为通用碱去质子化3-羟基，Asp124参与质子中继；H25A突变几乎失活。 |
关键发现
- UGT76G1能催化STB→Reb B、Reb A→Reb I、ST→Reb A→Reb I、Reb E→Reb D→Reb M、Rubu→RX（单糖基化）→RY（二糖基化）等反应
- 动力学参数：UDPG的Km=5.6±0.4 μM、kcat=4.1±0.1 min-1
- STB的Km=4.8±0.4 μM、kcat=4.8±0.1 min-1
- ST的Km=25.5±3.4 μM、kcat=41.8±1.4 min-1
- Reb E的Km=9.2±0.7 μM、kcat=21.3±0.5 min-1
- Rubu的Km=54.4±4.0 μM、kcat=5.9±0.1 min-1
- Reb D的Km=94.2±15.5 μM、kcat=3.3±0.2 min-1
- H25A突变体kcat降至野生型的10^-5，H25N完全失活
- 结构显示葡萄糖A仅与His25形成一个氢键，二萜骨架由Leu85、Met88、Ile90、Asn196、Ile199、Leu200和Ile203构成的疏水口袋包围
- 4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷可被UGT76G1糖基化（质量增加162 Da），表明疏水芳环可替代甜菊醇骨架。
研究结论
UGT76G1采用疏水相互作用识别底物，这种非定向的疏水识别赋予同一活性位点结合两种不同底物方向的能力，从而在甜菊糖苷分子的R1和R2两个不对称位点进行β(1-3)糖基化。该机制为甜菊糖苷类零热量甜味剂（如Reb D和Reb M）的高效生物合成及糖基转移酶的理性工程改造提供了理论基础。