An anaerobic bacterium host system for heterologous expression of natural product biosynthetic gene clusters
- 作者
- Tingting Hao, Zhoujie Xie, Min Wang, Liwei Liu, Yuwei Zhang, Weicang Wang, Zhao Zhang, Xuejin Zhao, Pengwei Li, Zhengyan Guo, Shushan Gao, Chunbo Lou, Guodong Zhang, Justin Merritt, Geoff P. Horsman, Yihua Chen
- 杂志
- Nature Communications（2019）
- DOI
- 10.1038/s41467-019-11673-0
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
厌氧细菌来源的天然产物生物合成基因簇（BGCs）因培养困难和遗传操作难而难以评估其产物，缺乏有效的异源表达宿主系统。
研究策略
选用兼性厌氧菌 Streptococcus mutans UA159 作为异源表达宿主，开发基于自然转化的 NabLC（natural competence based large DNA fragment cloning）技术，将来自不同厌氧菌的大片段 BGCs 直接整合到宿主基因组中，并通过组成型或诱导型启动子激活目标 BGC 以鉴定其产物。
研究路线图
核心内容
针对厌氧菌来源天然产物基因簇难以通过传统宿主表达的问题，本研究建立了一套以兼性厌氧菌变异链球菌（Streptococcus mutans UA159）为基础的异源表达系统。研究人员开发了基于自然转化的NabLC大片段克隆技术，可将长达40 kb的DNA片段一步整合入宿主基因组，并通过多轮组装实现73.7 kb BGC6的完整整合。利用tetM反向筛选系统，背景存活率降至(1.0±0.1)×10⁻⁸，较PheS系统降低约一个数量级。该平台成功激活了多个异源BGC，包括通过木糖诱导BGC1产生新化合物mutanocyclin（C₁₀H₁₅NO₃），并经NMR及化学合成确认其(R)-构型；BGC4激活后产生脂肽SNC1-465，敲除orfF后产物消失。Matrigel plug实验显示10 μg mutanocyclin可显著抑制CD45⁺白细胞浸润，提示其具有免疫调节活性。该工作为厌氧菌BGC的高效克隆、表达和产物鉴定提供了通用平台，有望推动厌氧菌天然产物的系统挖掘与功能研究。
创新点
1. 开发了 NabLC 技术，可一步克隆高达 40-kb 的 DNA 片段，并通过多轮组装将 73.7-kb 的 BGC6 分段整合到宿主基因组。2. 建立了 S. mutans UA159 作为厌氧菌 BGC 异源表达宿主系统，成功表达多个异源 BGC。3. 发现并鉴定了新化合物 mutanocyclin（C10H15NO3）和 SNC1-465（C28H36N2O4），其中 mutanocyclin 具有抑制白细胞浸润的免疫调节活性。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptococcus mutans UA159 | 多种天然产物生物合成 | — | MubP | 催化 | 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，组成型表达以激活 PKS/NRPS 的硫醇化结构域，支持异源 BGC 的功能表达。 |
| Streptococcus mutans UA159/BGC1 | NRPS/PKS | mucD, mucE | MutD, MutE | 催化 | 来自 S. mutans 35 的 BGC1，编码 tetramic acid 类化合物 mutanocyclin 的合成。 |
| Streptococcus mutans UA159/BGC2 | NRPS | BGC2基因簇 | NRPS | 催化 | 来自 Staphylococcus epidermidis ATCC 35984，编码 pyrazinones（tyrvalin, phevalin, leuvalin）。 |
| Streptococcus mutans UA159/BGC4 | NRPS/PKS | orfF, orfH | NRPS/PKS 酶 | 催化 | 来自 S. mutans NMT4863，编码脂肽 SNC1-465；orfF 预测参与半胱氨酸掺入形成噻唑环。 |
| Streptococcus mutans UA159 | — | gyrAp, xylSP | — | 调控 | 组成型启动子 gyrAp 和木糖诱导型启动子 xylSP 用于激活异源 BGC 的转录。 |
| Streptococcus mutans UA159 | — | xylR, pheS, tetM | XylR, PheS | 调控 | 反向筛选标记系统（PheS 和 tetM/ XylR）用于 NabLC 克隆过程中的正负筛选。 |
关键发现
- NabLC 技术可捕获 40-kb 的 DNA 片段，通过三轮克隆将
- 7-kb 的 BGC6 完整整合至 S. mutans UA159 基因组。
- 使用 tetM 反向筛选系统，背景存活率降至 (1.0±0.1)×10^-8，相比 PheS 系统的 (2.0±0.8)×10^-7 降低约一个数量级；BGC1 正确整合率提高约一个数量级。
- BGC2 在 S. mutans UA159 中成功激活，产生 tyrvalin、phevalin 和 leuvalin 三种 pyrazinone 产物。
- BGC1 被 xylose 诱导激活，产生 mutanocyclin（HR-MS m/z
- 1124 [M+H]+，计算值
- 1125），其结构经 NMR 和化学合成确认，(R)-构型。
- BGC4 激活后产生 SNC1-465（HR-MS m/z
- 2761 [M+H]+，计算值
- 2753），敲除 orfF 后该产物消失。
- 在 Matrigel plug 实验中，10 μg mutanocyclin 显著抑制 CD45+ 白细胞浸润，显示抗炎/免疫调节作用。
研究结论
本研究建立了以兼性厌氧菌 S. mutans UA159 为基础的异源表达宿主系统，结合 NabLC 技术可高效捕获并组装厌氧菌的大片段 BGCs，成功激活并鉴定了多个 BGC 产物，包括具有抗浸润活性的新化合物 mutanocyclin 和脂肽 SNC1-465，为厌氧菌天然产物的挖掘和功能研究提供了有力平台。