Robust and flexible platform for directed evolution of yeast genetic switches
- 作者
- Masahiro Tominaga, Kenta Nozaki, Daisuke Umeno, Jun Ishii, Akihiko Kondo
- 杂志
- Nature Communications（2021）
- DOI
- 10.1038/s41467-021-22134-y
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
真核生物（酿酒酵母）遗传开关数量少且性能不佳，现有定向进化方法效率低，需要构建一个鲁棒且灵活的进化平台来快速创建和优化酵母遗传开关。
研究策略
构建基于三功能融合蛋白hsvTK-Ble-GFP（TBG）的液基选择系统，利用hsvTK作为OFF选择标记（磷酸化核苷类似物致死）、Ble作为ON选择标记（结合Zeocin解毒）、GFP作为荧光报告；通过可调阈值和并行液体处理，对合成转录因子进行随机突变和定向选择。
研究路线图
核心内容
该研究构建了一个基于三功能融合蛋白TBG（hsvTK-Ble-GFP）的液基定向进化平台，用于快速创建和优化酿酒酵母遗传开关。TBG蛋白整合了OFF选择标记hsvTK（可将核苷类似物磷酸化致细胞死亡）、ON选择标记Ble（结合Zeocin解毒）和GFP荧光报告，使选择过程仅需液体处理，可在多孔板中平行进行不同条件的筛选，且阈值灵活可调。通过20个独立定向进化实验，研究者对多种合成转录因子进行随机突变和选择，产生了性能显著提升的遗传开关。初始Tet-ON系统仅有约3倍诱导，最优变体rTetTA K8N,L131L在0.3和10 μg/mL Dox下分别达到8倍和11倍诱导，93个克隆中48%显示出超过5倍的诱导水平。单轮OFF/ON选择即可实现133倍富集，增加hENT1拷贝使逃逸频率降低超过100倍。此外，该平台还成功反转了开关行为（构建DAPG-ON和HSL-ON变体）、提高了信噪比，并将优化后的正交开关即插即用地整合到AND门控的β-胡萝卜素生物合成通路中，实现了需要DAPG和HSL同时存在的逻辑门控。该平台为真核合成生物学提供了高效、灵活的工具，有望加速酵母遗传开关的工程化应用。
创新点
['开发了TBG三功能融合蛋白，实现无缝的ON/OFF选择和荧光定量', '所有选择过程仅需液体处理，可在多孔板中平行进行不同条件筛选', '选择阈值灵活可调，无需预先了解文库分布', '通过20个独立定向进化实验，产生了多种性能提升的遗传开关（提高诱导灵敏度、反转开关行为、感知功能、信噪比>100倍）', '可即插即用地整合到AND门控的β-胡萝卜素生物合成通路中']
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | Tet-ON 遗传开关 | rtetTA (rtTA2S-M2) | rTetTA | 调控 | 合成转录激活因子，通过易错PCR随机突变并筛选得到K8N和L131L突变，提高Dox诱导倍数至11倍。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | Tet-ON 遗传开关 | hsvtk | hsvTK（单纯疱疹病毒胸苷激酶） | 催化 | 作为OFF选择标记，磷酸化5FdU或dP产生毒性核苷酸，用于筛选低泄漏变体。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | Tet-ON 遗传开关 | ble | Ble (Sh ble，来自 Streptococcus hinduastanus) | 催化 | 作为ON选择标记，结合并失活Zeocin；引入D25A突变以降低活性，使选择阈值可调。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | Tet-ON 遗传开关 | hENT1 | hENT1（人类均衡核苷转运体1） | 转运 | 整合到染色体，促进核苷类似物5FdU/dP的细胞摄取，为OFF选择所必需。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | DAPG-OFF 遗传开关 | phiTA | PhlTA（PhIF-VP48-NLS融合蛋白） | 调控 | 原始构建无效且有毒性，经定向进化获得功能性突变体（1-2E和1-6H），DAPG存在下表达下降4倍。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | Camphor-OFF 遗传开关 | camTA | CamTA（CamR-VP48-NLS融合蛋白） | 调控 | 原始泄漏高，进化后变体1-8D信噪比提高2倍；A695del移码丢失NLS是功能优化关键。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | DAPG-ON 遗传开关 | phiTA变体 | PhlTA 1-11E, 2-1E等 | 调控 | 通过OFF/ON选择获得DAPG反向激活功能，1-11E实现8倍诱导，第二代变体EC50降低8倍。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | HSL-ON 遗传开关 | luxTA | LuxTA（LuxR-VP48-NLS融合蛋白） | 调控 | 野生型无功能，通过两轮诱变和选择获得变体（S116Y, W201R），在3 μM HSL下增强6倍表达。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | β-胡萝卜素生物合成通路 | BTS1 | Bts1p（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶） | 催化 | 来自酿酒酵母自身基因，将FPP转化为GGPP。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | β-胡萝卜素生物合成通路 | crtYB | CrtYB（来自Xanthophyllomyces dendrorhous的八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶） | 催化 | 双功能酶，催化八氢番茄红素合成及番茄红素环化。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | β-胡萝卜素生物合成通路 | crtI | CrtI（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，催化脱氢生成番茄红素。 |
关键发现
- 初始Tet-ON系统仅有约3倍诱导
- 引入Ble D25A突变后，在2 mM Zeocin下细胞存活率与TBG荧光成正比
- 在100 nM 5FdU下，携带rTetTA的细胞在有Dox时失去活性，无Dox时活性降低
- 最佳Tet-ON变体rTetTA K8N,L131L在0.3和10 μg/mL Dox下分别诱导8倍和11倍
- 93个克隆中48%显示超过5倍诱导
- DAPG-OFF突变体表达下降4倍
- Camphor-OFF变体信噪比提高2倍
- DAPG-ON变体1-11E实现8倍诱导，第二代变体EC50降低达8倍
- HSL-ON变体在3 μM HSL下增强6倍表达
- 单轮OFF/ON选择实现133倍富集
- 5FdU/dP抗性克隆频率为10^-3，增加hENT1拷贝使逃逸减少>100倍
- 整合后的正交开关诱导因子>10^2
- β-胡萝卜素AND门控需要DAPG和HSL同时存在。
研究结论
该研究建立的定向进化平台能够快速、灵活地创建和优化酿酒酵母遗传开关，并将所得开关即插即用地整合到代谢通路实现逻辑门控，为真核合成生物学提供了有力工具。