Marker-free carotenoid-enriched rice generated through targeted gene insertion using CRISPR-Cas9
- 作者
- Oliver Xiaoou Dong, Shu Yu, Rashmi Jain, Nan Zhang, Phat Q. Duong, Corinne Butler, Yan Li, Anna Lipzen, Joel A. Martin, Kerrie W. Barry, Jeremy Schmutz, Li Tian, Pamela C. Ronald
- 杂志
- Nature Communications（2020）
- DOI
- 10.1038/s41467-020-14981-y
- 所属领域
- 代谢工程 / 植物生物技术
- 关键词
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解决的核心问题
传统农杆菌或基因枪转化导致外源基因随机插入，可能引起产量下降；且靶向插入通常依赖选择标记或仅限于小片段。本研究旨在利用CRISPR-Cas9在水稻基因组安全港实现大片段（5.2 kb）无标记基因盒的靶向插入，获得无标记且富含类胡萝卜素的水稻。
研究策略
预先从快中子突变体中筛选出不影响形态的基因组安全港（GSHs），通过CRISPR-Cas9在靶位点（Target B和C）诱导双链断裂，利用共转化的供体质粒（含5.2 kb类胡萝卜素合成盒和同源臂）经NHEJ实现定向插入；通过遗传分离和回交去除共整合的Cas9质粒及多余质粒片段，获得纯合无标记株系。
研究路线图
核心内容
本研究利用CRISPR-Cas9系统，首次在水稻中实现了5.2 kb无标记类胡萝卜素合成盒（含ZmPsy和SSU-crtI）的靶向插入。研究者预先从快中子突变体中筛选出不影响形态的基因组安全港，通过共转化供体质粒经NHEJ修复实现定向插入，并经遗传分离和回交去除共整合质粒片段，最终获得纯合无标记株系。在靶位点B获得的纯合株系48A-7中，种子β-胡萝卜素含量达7.90 ± 0.19 μg/g干重，而野生型未检出，该水平低于温室条件下GR2E（9.22 μg/g）但高于田间种植的PSB Rc82（1.96–7.31 μg/g）。靶位点C的插入频率为6.25%。全基因组测序未检测到Cas9脱靶突变，且48A-7在株型、粒长、粒宽和粒重上与野生型无显著差异，后代表现符合1:3孟德尔分离比例。这一策略证明了大片段无标记DNA精准插入的可行性，为作物合成生物学应用提供了不依赖选择标记、不损害农艺性状的遗传改良新途径。
创新点
['首次在水稻中实现5.2 kb无标记DNA片段的高效靶向插入', '在预先鉴定的基因组安全港插入，不影响形态和产量', '通过全基因组测序验证无Cas9脱靶突变', '通过回交策略去除共整合质粒片段，获得纯合无标记材料']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 水稻（Oryza sativa ssp. japonica 品种 Kitaake） | 类胡萝卜素生物合成途径 | ZmPsy | 八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase） | 催化 | 来自玉米，由谷蛋白启动子驱动，在胚乳中特异表达，催化GGPP生成八氢番茄红素 |
| 水稻（Oryza sativa ssp. japonica 品种 Kitaake） | 类胡萝卜素生物合成途径 | SSU-crtI | 类胡萝卜素脱饱和酶（CrtI）与豌豆RUBISCO小亚基转运肽的融合蛋白 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，融合转运肽引导蛋白定位，催化八氢番茄红素脱饱和 |
| 水稻（Oryza sativa ssp. japonica 品种 Kitaake） | CRISPR-Cas9基因编辑系统 | Cas9 (Cas9p) | Cas9核酸酶 | 催化 | Poaceae密码子优化版本，由玉米Ubi1启动子驱动，在靶位点产生双链断裂 |
| 水稻（Oryza sativa ssp. japonica 品种 Kitaake） | CRISPR-Cas9基因编辑系统 | gRNA B / gRNA C | — | 调控 | 引导Cas9至基因组安全港Target B和Target C位点 |
| 水稻（Oryza sativa ssp. japonica 品种 Kitaake） | 无（选择标记） | HygR | 潮霉素磷酸转移酶 | 催化 | 潮霉素抗性选择标记，用于筛选转化体，最终通过遗传分离去除 |
| 水稻（Oryza sativa ssp. japonica 品种 Kitaake） | 无（调控元件） | 谷蛋白启动子（glutenin promoter） | — | 调控 | 胚乳特异性启动子，驱动ZmPsy和SSU-crtI在种子胚乳中表达 |
关键发现
- 成功将5.2 kb类胡萝卜素合成盒靶向插入水稻基因组两个安全港（Target B和C）。在Target B获得纯合无标记株系48A-7，其种子β-胡萝卜素含量为7.90 ± 0.19 μg/g干重，而野生型Kitaake未检测到
- 该含量略低于温室条件下GR2E（9.22 μg/g干重），但高于田间种植的indica品种PSB Rc82（1.96-7.31 μg/g干重）。Target C的插入频率为1/16（6.25%）。T0植株中7株（#11,16,17,24,28,48,50）携带相同插入，经分析源于单一转化事件。全基因组测序未检测到预测的Cas9脱靶位点突变。48A-7与Kitaake在株型、粒长、粒宽和粒重上无显著差异。遗传共分离分析中，48P-3后代表现13白籽:38金籽的1:3孟德尔比例，且金籽表型与插入共分离。
研究结论
本研究证明CRISPR-Cas9可以在水稻基因组安全港实现大片段无标记DNA的靶向插入，获得无标记、富含β-胡萝卜素且农艺性状不受影响的水稻，为作物遗传改良和合成生物学应用提供了可行策略。