Structural insight on assembly-line catalysis in terpene biosynthesis
- 作者
- Jacque L. Faylo, Trevor van Eeuwen, Hee Jong Kim, Jose J. Gorbea Colón, Benjamin A. Garcia, Kenji Murakami, David W. Christianson
- 杂志
- Nature Communications（2021）
- DOI
- 10.1038/s41467-021-23589-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明双功能萜烯合酶PaFS中前转移酶与环化酶两个结构域协同催化及底物通道的结构机制
研究策略
综合运用冷冻电镜、负染电镜、化学交联质谱（XL-MS）和整合建模，解析全长PaFS的寡聚结构，并分析环化酶结构域的动态构象
研究路线图
核心内容
该研究综合运用冷冻电镜、负染电镜、化学交联质谱和整合建模，解析了双功能萜烯合酶PaFS的寡聚结构。结果显示，全长PaFS主要以八聚体形式存在，前转移酶结构域形成中央核心，八个环化酶结构域通过约70残基的柔性linker向外延伸，冷冻电镜将前转移酶八聚体解析至3.99 Å分辨率。环化酶结构域与核心的平均质心距为114±28 Å，范围达54–196 Å，交联实验进一步表明环化酶可接近核心甚至封盖中心孔，说明其位置高度动态，不存在固定的分子隧道。动力学表征显示，前转移酶催化DMAPP与IPP缩合的kcat/KM为7.3 M⁻¹s⁻¹，而环化酶催化GGPP环化的kcat/KM高达9300 M⁻¹s⁻¹，竞争实验证实大部分GGPP在生成后直接留在酶上被环化。该工作首次揭示PaFS的底物通道由前转移酶核心周围聚集的多个动态环化酶形成的簇实现，提出了动态簇通道机制，为理解多结构域萜烯合酶的协同催化提供了结构基础。
创新点
首次解析全长PaFS的前转移酶八聚体核心结构（3.99 Å），揭示环化酶结构域通过柔性linker呈可变分布，提出动态簇通道（dynamic cluster channeling）机制
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 二萜生物合成（Fusicoccin A） | — | Fusicoccadiene synthase (PaFS) | 催化 | 双功能酶，N端环化酶，C端前转移酶 |
| — | 二萜生物合成 | — | Prenyltransferase domain of PaFS (C-terminal) | 催化 | 催化DMAPP和IPP生成GGPP |
| — | 二萜生物合成 | — | Cyclase domain of PaFS (N-terminal) | 催化 | 催化GGPP环化为fusicoccadiene |
关键发现
- 全长PaFS主要以八聚体形式存在（另有六聚体），前转移酶结构域形成中央核心，八个环化酶结构域通过约70残基的柔性linker向外延伸。冷冻电镜解析前转移酶八聚体至3.99 Å分辨率
- 环化酶结构域与核心的平均质心距为114±28 Å，范围为54–196 Å。交联实验显示环化酶可接近核心，甚至封盖中心孔。动力学表征：前转移酶催化DMAPP+IPP的kcat=1.01±0.09×10^-3 s^-1，KM=139±16 μM，kcat/KM=7.3±1.5 M^-1s^-1，Hill系数2.0±0.3
- 环化酶催化GGPP的kcat=0.059±0.004 s^-1，KM=6.4±0.4 μM，kcat/KM=9300±1100 M^-1s^-1，Hill系数3.0±0.4。竞争实验表明大部分GGPP留在酶上被环化，支持底物通道效应。
研究结论
PaFS的环化酶结构域位置高度动态，不存在分子隧道；底物通道由前转移酶核心周围聚集的多个环化酶形成的动态簇实现，即动态簇通道，从而保证GGPP高效传递并减少扩散损失。