Biocatalytic routes to stereo-divergent iridoids
- 作者
- Néstor J. Hernández Lozada, Benke Hong, Joshua C. Wood, Lorenzo Caputi, Jérôme Basquin, Ling Chuang, Maritta Kunert, Carlos E. Rodríguez López, Chloe Langley, Dongyan Zhao, C. Robin Buell, Benjamin R. Lichman, Sarah E. O'Connor
- 杂志
- Nature Communications（2022）
- DOI
- 10.1038/s41467-022-32414-w
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用天然和工程化酶系统产生多种立体异构的环烯醚萜骨架（nepetalactol/nepetalactone），以拓展这类重要天然产物的结构多样性。
研究策略
通过基因挖掘（从Nepeta sibirica中鉴定新NEPS）、酶工程（定点突变和结构域交换）、结构解析（晶体结构）以及组合生物合成（结合7S/7R选择性ISY与NEPS/MLPL），实现环烯醚萜立体异构体的酶法合成。
研究路线图
核心内容
本研究通过基因挖掘与酶工程策略，系统拓展了环烯醚萜类天然产物的立体化学多样性。作者从Nepeta sibirica中鉴定出6个新的NEPS同源酶，并结合晶体结构解析与定点突变，揭示了NEPS催化环化和氧化反应的关键结构元件。通过将不同立体选择性的环烯醚萜合酶（如7S-ISY和7R-ISY）与天然或工程化NEPS组合，建立了体外组合生物合成平台，成功获得了7种可能的荆芥内酯立体异构体中的7种，包括非天然的7S-trans-cis异构体。其中，单点突变NsNEPS2-Y167F有效解偶联了环化与氧化活性，而NmNEPS1经五个位点改造后获得了全新的环化能力。关键突变如NcNEPS3A-V206Q完全丧失氧化功能，反向突变则恢复活性。NsNEPS2晶体结构解析至1.85 Å（PDB 7QUJ），为理解立体选择性机制提供了结构基础。该工作不仅实现了多种环烯醚萜异构体的酶法合成，还建立了可预测的NEPS工程改造平台，为这类重要天然产物的多样化衍生提供了多功能酶工具箱。
创新点
['发现N. sibirica中的新NEPS酶，包括能产生7S-trans-trans异构体的NsNEPS1B', '通过单点突变（如NsNEPS2-Y167F）成功解偶联NEPS的环化和氧化活性', '鉴定控制环化立体选择性的关键结构元件（如第206位残基、第150-162环区）', '利用组合生物合成策略获得7/8种可能的荆芥内酯立体异构体', '首次揭示N. sibirica叶片中主要积累7R-trans-trans异构体']
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | CrISY | Iridoid synthase (7S-ISY) | 催化 | 来自Catharanthus roseus，催化8-氧代香叶醛还原环化 |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | NsISY | Iridoid synthase (7S-ISY) | 催化 | 来自Nepeta sibirica，经鉴定为7S特异性 |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | LaISY | Iridoid synthase (7R-ISY) | 催化 | 来自Lamium album，天然7R特异性ISY |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | NsNEPS2 | Nepetalactol-related short-chain reductase 2 | 催化 | N. sibirica，7S-cis-trans选择性环化/氧化酶；Y167F突变体失去氧化活性仅保留环化 |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | NmNEPS3 | Nepetalactol-related short-chain reductase 3 | 催化 | N. mussinii，7S-cis-cis环化酶，氧化活性极弱；Q206V突变体恢复氧化活性 |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | NcNEPS3A | Nepetalactol-related short-chain reductase 3A | 催化 | N. cataria，与NmNEPS3有93%同一性，兼具7S-cis-cis环化和氧化活性；V206Q突变体失去氧化活性 |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | NmNEPS1 | Nepetalactol-related short-chain reductase 1 | 催化 | N. mussinii，天然无环化活性但可氧化多种荆芥内酯醇；经工程改造（154SATA+L198）获得7S-trans-cis环化活性 |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | NmNEPS4 | Nepetalactol-related short-chain reductase 4 | 催化 | N. mussinii，7S-trans-cis选择性环化酶，仅能氧化7S-cis-trans |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | NsNEPS1A | Nepetalactol-related short-chain reductase 1A | 催化 | N. sibirica，与7S-ISY偶联生成7S-cis-trans，与7R-ISY偶联主要生成7R-trans-trans |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | NsNEPS1B | Nepetalactol-related short-chain reductase 1B | 催化 | N. sibirica，与7S-ISY偶联产生所有四种7S异构体（含7S-trans-trans），与7R-ISY偶联产生7R-trans-trans和7R-cis-trans |
| 体外酶促反应 | 环烯醚萜生物合成 | NsMLPL1/2 | Major latex like protein 1/2 | 催化 | N. sibirica，MLPL1为3a环化酶；MLPL2与NsNEPS1B组合产生7R-cis-cis副产物 |
关键发现
- 鉴定了6个新的N. sibirica NEPS同源物（NsNEPSL, NsNEPS1A/B, NsNEPS2, NsNEPS4A/B）
- NsNEPS2与7S-ISY反应专一产生7S-cis-trans荆芥内酯（4a），其Y167F突变体仅产生7S-cis-trans荆芥内酯醇（3a），实现环化/氧化解偶联
- NmNEPS3-Q206V突变体恢复氧化活性，产量与NcNEPS3A相当，而NcNEPS3A-V206Q突变体仅产生荆芥内酯醇（3b）
- 通过5个突变（154SATA+L198）赋予NmNEPS1环化活性，产生7S-trans-cis iridodial（5c）
- 将L198反向突变获得非天然的7S-trans-cis荆芥内酯（4c）
- NsNEPS1B与7S-ISY反应产生所有四种7S异构体，包括7S-trans-trans（4d）
- 使用7R-ISY（LaISY）与NsNEPS1A结合主要产生7R-trans-trans荆芥内酯（4d'），少量7R-cis-trans（4a'）
- NsNEPS1B+NsMLPL2组合产生7R-cis-cis（4b'）副产物
- 最终实现了7/8种荆芥内酯立体异构体的酶法合成
- NsNEPS2晶体结构解析至1.85 Å（PDB 7QUJ）。
研究结论
本研究通过基因发现和酶工程，开发了能够产生七种环烯醚萜立体异构体的生物催化系统，揭示了NEPS酶环化与氧化选择性的结构基础，为环烯醚萜类天然产物的生物合成和衍生化提供了多功能酶工具箱。