Expanding the terpene biosynthetic code with non-canonical 16 carbon atom building blocks
- 作者
- Codruta Ignea, Morten H. Raadam, Aikaterini Koutsaviti, Yong Zhao, Yao-Tao Duan, Maria Harizani, Karel Miettinen, Panagiota Georgantea, Mads Rosenfeldt, Sara E. Viejo-Ledesma, Mikael A. Petersen, Wender L. P. Bredie, Dan Staerk, Vassilios Roussis, Efstathia Ioannou, Sotirios C. Kampranis
- 单位
- University of Copenhagen, Denmark; National and Kapodistrian University of Athens, Greece
- 杂志
- Nature Communications（2022）
- DOI
- 10.1038/s41467-022-32921-w
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
天然萜类化合物的生物合成基于C5异戊二烯单元，导致化学空间局限于C10、C15、C20等碳数为5倍数的结构，非经典碳数（如C16）的萜烯无法通过天然途径高效合成。本文旨在通过工程化酵母合成非经典的C16异戊二烯构建模块，并重建下游萜烯合成模块，从而扩展萜类化学空间。
研究策略
将来自Serratia plymuthica的甲基转移酶SpSodMT引入高产FPP的酿酒酵母菌株AM109，建立FPP甲基化生成PSPP的路径；通过理性设计和突变SpSodMT活性位点残基，获得产生9种额外C16异戊二烯二磷酸的变体；筛选能利用这些非经典底物的萜烯合酶（Cyc2和HaKS）和细胞色素P450（PtAO），在酵母中重建从C16构建模块到萜烯骨架再到氧化衍生物的完整模块化生物合成。
研究路线图
核心内容
该研究通过将来自粘质沙雷氏菌的甲基转移酶SpSodMT引入高产法尼基焦磷酸的酿酒酵母菌株AM109，建立了非经典C16异戊二烯二磷酸（PSPP）的从头生物合成途径。通过理性设计SpSodMT活性位点残基，获得了能产生9种额外C16构建模块的突变体，其中SpSodMT(V273A)总C16产量达43 mg/L。研究进一步筛选并利用能接受C16底物的萜烯合酶Cyc2和HaKS以及细胞色素P450 PtAO，在酵母中重建了从C16模块到萜烯骨架再到氧化衍生物的完整模块化合成路线，使1b产量达59.3 mg/L。最终共分离并结构鉴定了28种前所未有的C16萜烯，其中4种具有特征气味活性。该工作通过工程化非经典异戊二烯构建模块，系统扩展了萜类化学空间，为可持续生产高价值萜类化合物提供了新平台。
创新点
['首次在酿酒酵母中系统合成10种非经典的C16异戊二烯二磷酸构建模块', '通过蛋白工程将一个甲基转移酶改造为多种C16二磷酸合酶，扩展其产物谱', '鉴定出能接受C16底物的萜烯合酶Cyc2和HaKS，实现非经典萜烯骨架的构建', '发现细胞色素P450 PtAO能氧化C16萜烯，生成多种氧化衍生物', '共合成并结构鉴定28种前所未有的C16萜烯，其中部分具有气味活性']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae (菌株AM109) | 甲羟戊酸途径 | — | — | 区室化 | 基因工程改造的高FPP生产菌株，作为合成非经典C16萜烯的底盘细胞。 |
| — | 非经典C16异戊二烯构建模块生物合成 | — | — | 调控 | 包括由SpSodMT催化FPP甲基化和环化、萜烯合酶环化、P450氧化等模块，重建了萜烯生物合成的模块化结构。 |
| — | 非经典C16异戊二烯构建模块生物合成 | SpSodMT | SpSodMT (S-腺苷甲硫氨酸依赖性C-甲基转移酶) | 催化 | 来自Serratia plymuthica，催化FPP的C-10甲基化和环化生成PSPP；通过理性突变产生9种额外C16二磷酸构建模块。 |
| — | 非经典C16异戊二烯构建模块生物合成 | SpSodMT变体 (如F58V, F58L, V273A等) | SpSodMT变体 | 催化 | 工程突变体，选择性合成不同的C16二磷酸，如F58V主要产生PPP（77.1%），V273A主要产生WPP（80.3%），F58L偏好TPP（61.0%）。 |
| — | C16萜烯骨架合成 | Cyc2 | terpentetriene synthase | 催化 | 来自Kitasatospora griseola，能转化PSPP、PPP、TPP和WPP生成C16烯烃（如1d、2d）及少量叔醇。 |
| — | C16萜烯骨架合成 | HaKS | kolavelool synthase | 催化 | 来自Herpetosiphon aurantiacus，专一产生C16叔醇，如1b、2b、3b等。 |
| — | C16萜烯氧化修饰 | PtAO | CYP720B1 | 催化 | 细胞色素P450氧化酶，氧化C16萜烯骨架，如将1b羟基化为13OH-1b，将3b羟基化为9OH-3b。 |
| — | C16萜烯氧化修饰（电子传递） | CPR2 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 来自杂交杨，为PtAO提供电子，是P450氧化还原伴侣。 |
| — | C16二磷酸去磷酸化 | LPP1/DPP1 | 脂质磷酸酶 | 催化 | 酵母内源磷酸酶，将过量的C16异戊二烯二磷酸水解为相应的伯醇（如1a、2a）。 |
| — | C16伯醇还原 | OYE2 | NADPH氧化还原酶 | 催化 | 酵母内源烯还原酶，催化C16伯醇的2,3-双键还原，生成二氢衍生物（如1c、2c）。 |
关键发现
- 在AM109酵母中表达SpSodMT成功合成PSPP，其水解产物1a和1b产量分别达15.3 mg/L和10.7 mg/L，而FPP衍生的橙花叔醇和法尼醇产量仅为3.6和0.42 mg/L
- 通过突变获得9种额外C16构建模块，其中SpSodMT(F58V)产生77.1%的PPP，SpSodMT(V273A)产生80.3%的WPP，SpSodMT(F58L)体外偏好产生TPP（61.0%），SpSodMT(F58M)总C16产量达34.4 mg/L，SpSodMT(V273A)总C16产量达43 mg/L
- HaKS将C16底物转化为叔醇，使1b产量达59.3 mg/L，Cyc2产生C16烯烃1d和2d，产量分别为11.6和5.4 mg/L
- PtAO氧化1b和3b，生成13OH-1b（35.34 mg/L）和9OH-3b（8.82 mg/L）
- 共分离并结构鉴定28种非经典C16萜烯
- GC-MS-嗅闻分析确定4种具有特征气味的化合物：3a（烧焦）、9OH-3b（焦玫瑰）、4a（旧啤酒）、epi-5b（木质）。
研究结论
本研究通过合成生物学和蛋白工程成功在酵母中建立了非经典C16异戊二烯构建模块的完整生物合成途径，并利用这些模块合成了28种前所未有的C16萜类化合物，其中一些具有气味活性。该策略证明了通过工程化非经典构建模块可以极大地扩展萜类化学空间，为可持续生产高价值萜类化合物提供了新平台。