Deletion and tandem duplications of biosynthetic genes drive the diversity of triterpenoids in Aralia elata
- 作者
- Yu Wang, He Zhang, Hyok Choi, Zeyu An, Xin Wang, Jia-Nan Zhou, Dongran Zheng, Hao Wu, Pengchao Wang, Jianfei Yang, Ding-Kun Liu, Diyang Zhang, Wen-Chieh Tsai, Zheyong Xue, Zhichao Xu, Peng Zhang, Zhong-Jian Liu, Hailong Shen, Yuhua Li
- 杂志
- Nature Communications（2022）
- DOI
- 10.1038/s41467-022-29908-y
- 所属领域
- 合成生物学；代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析龙牙楤木（Aralia elata）中三萜皂苷结构多样性的进化机制，揭示其与近缘人参属在达玛烷型和齐墩果烷型三萜皂苷组成上差异的遗传基础，并实现aralosides的异源生物合成。
研究策略
通过染色体水平基因组测序与组装，结合比较基因组学、基因表达分析、体外酶活鉴定和酵母异源表达体系，系统解析三萜皂苷生物合成基因的进化与功能。
研究路线图
核心内容
龙牙楤木三萜皂苷的结构多样性远超近缘人参属，但其遗传基础尚不清楚。该研究通过染色体水平基因组测序，组装出1.05 Gb的龙牙楤木基因组，支架N50达85.56 Mb。比较基因组分析发现，达玛烷型合酶（DDS）基因在进化中缺失12个外显子，仅保留5个，导致龙牙楤木丧失达玛烷型皂苷合成能力，而过表达人参PgDDS可恢复其愈伤组织中达玛烷二醇型皂苷的积累。同时，P450、CSLM和UGT基因家族的串联重复事件驱动了齐墩果烷型五环三萜的结构多样化：AeCYP72A935/936催化齐墩果酸C23位羟基化生成常春藤皂苷元，AeCSLM1/2催化C3位葡萄糖醛酸基化，AeUGT73CB3对calenduloside E的Km比对chikusetsusaponin IVa低12.5倍，催化效率更高，AeUGT74AG6负责C28位糖基化。最终，在酿酒酵母中组合表达AeBAS、AeCYP716A354、AeCYP716A355、AeCYP72A936、AeCSLM1、AeUGT73CB3和AeUGT74AG6等基因，实现了13种齐墩果烷型三萜皂苷的从头合成。该研究揭示了基因缺失与串联重复共同塑造三萜多样性的进化机制，并为三萜皂苷异源制造提供了酶学元件与合成策略。
创新点
首次报道龙牙楤木染色体级基因组；发现DDS基因在进化中缺失12个外显子导致达玛烷型皂苷丧失；揭示P450、CSL、UGT基因的串联重复事件驱动齐墩果烷型五环三萜的多样性；在酿酒酵母中通过组合表达实现了13种aralosides的从头合成。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aralia elata | 三萜皂苷合成 | DDS (pseudogene) | Dammarenediol synthase | 催化 | 编码达玛烯二醇合酶的基因在龙牙楤木基因组中缺失12个外显子，仅存5个外显子，导致无法合成达玛烷型四环三萜。 |
| Aralia elata | 三萜皂苷合成 | AeBAS1 (AE05G00216) | β-Amyrin synthase | 催化 | 催化2,3-氧化鲨烯环化生成β-香树脂醇，在叶片中高表达。 |
| Aralia elata | 三萜皂苷合成 | AeBAS2 (AE04G00581) | β-Amyrin synthase | 催化 | 与AeBAS1序列高度相似，酵母中验证具有β-香树脂醇合酶活性。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜合成 | AeCYP716A354 (AE01G03625) | 细胞色素P450单加氧酶 (CYP716A亚家族) | 催化 | 催化β-香树脂醇C28位氧化生成齐墩果酸。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜合成 | AeCYP716A355 (AE10G01443) | 细胞色素P450单加氧酶 (CYP716A亚家族) | 催化 | 催化齐墩果酸C16位羟基化生成棘囊酸。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜合成 | AeCYP72A935 (AE09G00610) | 细胞色素P450单加氧酶 (CYP72A亚家族) | 催化 | 串联重复基因对之一，催化齐墩果酸和棘囊酸C23位羟基化，生成常春藤皂苷元和16-OH-常春藤皂苷元，主要在茎中表达。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜合成 | AeCYP72A936 (AE09G00613) | 细胞色素P450单加氧酶 (CYP72A亚家族) | 催化 | 与AeCYP72A935功能冗余，同样催化C23位羟基化。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜合成 | AeCYP72A937 (AE09G02158) | 细胞色素P450单加氧酶 (CYP72A亚家族) | 催化 | 参与齐墩果烷型三萜骨架的羟基化修饰，具体催化位点见原文。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜糖基化 | AeCSLM1 (AE06G00237) | 纤维素合酶样M亚家族蛋白 (CSLM) | 催化 | 催化齐墩果烷型三萜3-O-葡萄糖醛酸基化，生成calenduloside E等。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜糖基化 | AeCSLM2 (AE06G00238) | 纤维素合酶样M亚家族蛋白 (CSLM) | 催化 | 与AeCSLM1串联重复且功能相同，但表达模式不同。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜糖基化 | AeUGT73CB3 (AE09G01544) | UDP-糖基转移酶 (UGT73亚家族) | 催化 | 催化calenduloside E C3位葡萄糖基化生成zingibroside R1，对calenduloside E的Km比chikusetsusaponin IVa低12.5倍，主要在叶片中表达。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜糖基化 | AeUGT73CB4 (AE09G01562) | UDP-糖基转移酶 (UGT73亚家族) | 催化 | 串联重复基因，具有与AeUGT73CB3相似的C3位糖基化活性，但催化效率低于AeUGT73CB3。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜糖基化 | AeUGT73CB5 (AE09G03873) | UDP-糖基转移酶 (UGT73亚家族) | 催化 | 与AeUGT73CB4功能类似，催化C3位葡萄糖基化。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜糖基化 | AeUGT73AD2 (AE09G02726) | UDP-糖基转移酶 (UGT73亚家族) | 催化 | 催化齐墩果烷型三萜C28位糖基化，对齐墩果酸具有较高亲和力。 |
| Aralia elata | 齐墩果烷型三萜糖基化 | AeUGT74AG6 (AE01G00407) | UDP-糖基转移酶 (UGT74亚家族) | 催化 | 主要在根部表达，催化calenduloside E和zingibroside R1的C28位糖基化，对zingibroside R1具有高催化效率。 |
| Aralia elata (callus) | 达玛烷型三萜皂苷合成 | PgDDS | Dammarenediol synthase (人参) | 催化 | 在龙牙楤木愈伤组织中过表达人参PgDDS，恢复了达玛烯二醇II及其羟基化衍生物的积累。 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜皂苷合成 | AtATR2 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为P450酶提供还原力（电子），来自拟南芥，在酵母菌株WAT21中表达。 |
| Saccharomyces cerevisiae | UDP-葡萄糖醛酸合成 | EcUGD1 | UDP-葡萄糖6-脱氢酶 (大肠杆菌) | 催化 | 催化UDP-葡萄糖氧化脱氢生成UDP-葡萄糖醛酸，为3-O-葡萄糖醛酸基化提供糖供体。 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸通路 | tHMG1, ERG20, ERG9, ERG1 | HMG-CoA还原酶、法尼基焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶 | 催化 | 过表达增强2,3-氧化鲨烯供应，促进三萜前体合成。 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 体外酶活检测 | AeUGT73AD2, AeUGT73CB3, AeUGT74AG6 等 | 重组UDP-糖基转移酶 | 催化 | 用于体外酶活及动力学参数测定。 |
关键发现
- 龙牙楤木基因组大小为1.05 Gb，支架N50为85.56 Mb，杂合度约0.57%，重复序列占65.60%
- DDS基因保留仅5个外显子（正常17个），缺失12个外显子
- 过表达人参PgDDS可恢复龙牙楤木愈伤组织中达玛烷二醇型皂苷的积累
- AeCYP72A935/936催化齐墩果酸C23位羟基化生成常春藤皂苷元，AeCYP72A937参与羟基化修饰
- AeCSLM1/2催化C3位葡萄糖醛酸基化
- AeUGT73CB3催化C3位葡萄糖基化，其对calenduloside E的Km比chikusetsusaponin IVa低12.5倍，kcat高2倍
- AeUGT74AG6催化C28位糖基化
- 在酵母中通过组合AeBAS、AeCYP716A354、AeCYP716A355、AeCYP72A936、AeCSLM1、AeUGT73CB3、AeUGT74AG6等基因，从头合成了13种齐墩果烷型五环三萜皂苷。
研究结论
龙牙楤木三萜皂苷的多样性主要源于DDS基因的部分缺失导致达玛烷型途径丧失，以及P450、CSL、UGT等基因的串联重复和差异表达；这些基因的组合可在酵母中重构并生产多种aralosides，为三萜皂苷的异源生物制造提供了新策略。