Catalytic flexibility of rice glycosyltransferase OsUGT91C1 for the production of palatable steviol glycosides
- 作者
- Jinzhu Zhang, Minghai Tang, Yujie Chen, Dan Ke, Jie Zhou, Xinyu Xu, Wenxian Yang, Jianxiong He, Haohao Dong, Yuquan Wei, James H. Naismith, Yi Lin, Xiaofeng Zhu, Wei Cheng
- 杂志
- Nature Communications（2021）
- DOI
- 10.1038/s41467-021-27144-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
最理想的甜菊糖苷Reb D和Reb M在天然甜菊中产量极低，原因是天然UGT91D2对R2端的β(1-2)糖基化活性不足，导致这些口味优良的甜菊糖苷仅在痕量水平存在。
研究策略
对水稻来源的糖基转移酶OsUGT91C1进行生化和结构表征，解析底物结合的多种模式，并基于结构理性设计突变，增强所需的β(1-2)糖基化活性、消除β(1-6)副反应，获得适合工业生产的催化剂。
研究路线图
核心内容
该研究针对天然甜菊中口感优良的甜菊糖苷Reb D和Reb M产量极低的问题，对具有催化混杂性的水稻糖基转移酶OsUGT91C1进行了系统改造。作者解析了该酶与UDP及多种甜菊糖苷底物的复合物晶体结构，发现底物可通过三种不同结合模式实现混杂催化，并据此设计了理性突变。通过F208M和F379A突变，R2端β(1-2)糖基化催化效率显著提升：双突变体对底物Rubu的kcat/Km达到3989 s⁻¹M⁻¹，较野生型提高5.9倍，对Reb A和S13G的催化效率也分别提升3.1倍和4.2倍。同时，H93W或F379A单突变可彻底消除β(1-6)糖基化副反应，H27A突变则导致酶完全失活。该研究通过结构指导的酶工程策略，获得了既能高效催化R2端β(1-2)糖基化又无副反应的工业适用催化剂，为高质量低热量甜味剂Reb D和Reb M的规模化生物合成提供了关键酶元件，有望突破此类稀有甜菊糖苷的生产瓶颈。
创新点
解析了OsUGT91C1的多种晶体结构（包括与UDP和多种甜菊糖苷的复合物），揭示了底物通过三种结合模式实现催化混杂性的分子机制；通过F208M和F379A等突变增强了R2端β(1-2)糖基化效率，并通过H93W或F379A突变彻底消除β(1-6)糖基化副反应。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 甜菊糖苷生物合成 | OsUGT91C1 | OsUGT91C1 | 催化 | 来自水稻的糖基转移酶，催化β(1-2)和β(1-6)糖基化 |
| — | 甜菊糖苷生物合成 | UGT76G1 | UGT76G1 | 催化 | 甜菊中的β(1-3)糖基转移酶，用于合成Reb D和Reb M的下游步骤 |
| — | 甜菊糖苷生物合成 | UGT91D2 | UGT91D2 | 催化 | 天然甜菊中的β(1-2)糖基转移酶，R2端活性极低 |
| — | 甜菊糖苷生物合成 | OsUGT91C1突变体 | F379A/F208M OsUGT91C1 | 催化 | 增强β(1-2)糖基化，消除β(1-6)糖基化活性 |
关键发现
- OsUGT91C1能高效催化β(1-2)糖基化到R1和R2端，且效率相当
- 同时催化β(1-6)糖基化副反应。F379A/F208M双突变体对Rubu的kcat/Km为3989 s-1 M-1，较野生型(673 s-1 M-1)提高5.9倍
- 对Reb A（仅R2端糖基化）的kcat/Km为6014 s-1 M-1，较野生型(1941 s-1 M-1)提高3.1倍
- 对S13G（R1端）的kcat/Km为1876 s-1 M-1，较野生型(445 s-1 M-1)提高4.2倍。H93W或F379A单突变可完全消除β(1-6)糖基化活性，H27A突变使酶完全失活。
研究结论
通过结构指导的酶工程改造，获得了能高效生产天然稀有但口感优良的甜菊糖苷Reb D和Reb M的催化剂，该催化剂增强了R2端β(1-2)糖基化并消除了β(1-6)副反应，有望解决高质量低热量甜味剂工业生产中的催化瓶颈。