Metabolic pathway assembly using docking domains from type I cis-AT polyketide synthases
- 作者
- Xixi Sun, Yujie Yuan, Qitong Chen, Shiqi Nie, Jiaxuan Guo, Zutian Ou, Min Huang, Zixin Deng, Tiangang Liu, Tian Ma
- 杂志
- Nature Communications（2022）
- DOI
- 10.1038/s41467-022-33272-2
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
工程化异源代谢通路缺乏自然组织，级联酶催化效率低，导致代谢通量失衡和目标产物产量低
研究策略
利用I型顺式AT聚酮合酶（cis-AT PKS）的对接结构域（docking domains, DDs）作为组装元件，开发mPKScal策略，将级联酶通过DDs共定位组装，提高底物通道和生物催化效率
核心内容
该研究开发了一种名为mPKScal的多酶组装策略，利用I型顺式AT聚酮合酶（cis-AT PKS）的对接结构域（DDs）作为模块化元件，实现级联酶的空间共定位，以解决工程化异源代谢通路缺乏自然组织、级联酶催化效率低的问题。研究者从DEBS和RAPS等PKS中分离DDs，体外实验证实其保留结合能力（KD值为0.28–14.6 μM），并通过荧光共定位验证了其在体内的引导作用。在大肠杆菌中，将该策略应用于虾青素合成途径：二酶组装（Idi-CrtE）使产量达14.7 mg/g DCW，较对照组（5.0 mg/g DCW）提高1.79倍；三酶组装（Idi-CrtE-CrtB）进一步提升至16.9 mg/g DCW，提高2.4倍。此外，来自不同PKS及跨类别的DDs组合均有效，产量达7.9–11.5 mg/g DCW。该工作验证了DDs作为通用组装工具在不同细胞区室（胞质、膜结合）中的适用性，为代谢工程提供了一种可扩展的多酶共定位工具库，有助于提升异源通路整体催化效率。
创新点
1. 首次将天然cis-AT PKS的对接结构域（DDs）用于非PKS酶的多酶组装；2. 开发mPKScal策略，在不同细胞区室（胞质、膜结合、胞质-膜）中实现二酶和三酶组装；3. 扩展了DDs工具库，验证了来自不同PKS和不同类别的DDs的兼容性；4. 通过DDs组装使虾青素产量提高2.4倍
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 虾青素生物合成途径 | idi | Idi（异戊烯基二磷酸异构酶） | 催化 | 连接上游MVA途径与下游类胡萝卜素途径的节点酶 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 虾青素生物合成途径 | crtE | CrtE（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶） | 催化 | 膜结合酶，催化GGPP合成 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 虾青素生物合成途径 | crtB | CrtB（八氢番茄红素合酶） | 催化 | 膜结合酶 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 虾青素生物合成途径 | crtY | CrtY（番茄红素β-环化酶） | 催化 | 膜结合酶 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 虾青素生物合成途径 | crtZ | CrtZ（β-胡萝卜素羟化酶） | 催化 | 膜结合酶 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 虾青素生物合成途径 | crtW | CrtW（β-胡萝卜素酮化酶） | 催化 | 膜结合酶 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）途径 | atoB | AtoB（乙酰辅酶A C-乙酰转移酶） | 催化 | 胞质酶 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG13 | ERG13（3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶） | 催化 | 胞质酶 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMG1 | tHMG1（3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶） | 催化 | 胞质酶，截短形式 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 聚酮合酶（PKS）组装 | docking domains D2DD/D3DD | DEBS D2DD-D3DD | 区室化 | 来自6-脱氧红霉内酯B合酶（DEBS）亚基间的对接结构域，用于酶共定位 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 聚酮合酶（PKS）组装 | docking domains D4DD/D5DD | DEBS D4DD-D5DD | 区室化 | 来自DEBS的第二个对接对 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 聚酮合酶（PKS）组装 | docking domains R4DD/R5DD | RAPS R4DD-R5DD | 区室化 | 来自雷帕霉素聚酮合酶（RAPS） |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 聚酮合酶（PKS）组装 | docking domains R10DD/R11DD | RAPS R10DD-R11DD | 区室化 | 来自RAPS的第二个对接对 |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 聚酮合酶（PKS）组装 | docking domains A1DD/A2DD/A3DD | AURS A1DD-A2DD、A2DD-A3DD | 区室化 | 来自金担子素合酶（AURS） |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 聚酮合酶（PKS）组装 | docking domains F4DD/F5DD/F6DD/F7DD | FKBS F4DD-F5DD、F6DD-F7DD | 区室化 | 来自他克莫司聚酮合酶（FKBS） |
| 大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) | 聚酮合酶（PKS）组装 | docking domains S7DD/S8DD | stigmatellin synthase S7DD-S8DD | 区室化 | 来自Stigmatella aurantiaca的stigmatellin合酶，属于H2-T2类 |
关键发现
- 体外互作实验表明，从DEBS和RAPS中分离的DDs仍保留结合能力，KD值分别为D2DD-D3DD
- 6±4.7 μM，D4DD-D5DD
- 28±0.08 μM，R4DD-R5DD
- 34±0.03 μM；体内荧光共定位证明DDs能引导Idi和CrtE共定位；在虾青素合成途径中，二酶组装（Idi-CrtE）使产量达14.7 mg/g DCW，比对照A0（5.0 mg/g DCW）提高1.79倍；三酶组装（Idi-CrtE-CrtB）使产量达16.9 mg/g DCW，提高2.4倍；来自AURS、FKBS、RAPS的DDs也能有效提高产量，分别达8.7、8.8、9.7 mg/g DCW；跨PKS同类别DDs组合组装也有效，产量达7.9-11.5 mg/g DCW。
研究结论
mPKScal策略通过将I型cis-AT PKS的对接结构域引入级联酶，实现酶的空间共定位，显著提高生物催化效率和目标产物（虾青素）产量，为代谢工程提供了一种强大的多酶组装工具库。