De novo biosynthesis of rubusoside and rebaudiosides in engineered yeasts
- 作者
- Yameng Xu, Xinglong Wang, Chenyang Zhang, Xuan Zhou, Xianhao Xu, Luyao Han, Xueqin Lv, Yanfeng Liu, Song Liu, Jianghua Li, Guocheng Du, Jian Chen, Rodrigo Ledesma-Amaro, Long Liu
- 杂志
- Nature Communications（2022）
- DOI
- 10.1038/s41467-022-30826-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
实现甜菊苷（rubusoside）和莱鲍迪苷（rebaudiosides）在酵母中的从头高效合成，解决天然植物提取效率低、成本高的问题，并克服途径限速步骤、产物毒性和代谢网络不平衡等瓶颈。
研究策略
采用模块化工程将复杂代谢途径分为多个模块，通过过表达MVA途径限速酶和工程化FPSF112A增加前体供应；利用蛋白融合和短肽标签构建底物通道提高P450催化效率；通过分子对接挖掘并过表达ABC外排泵PDR11，强化胁迫响应因子MSN4；利用基因组规模代谢模型（GSMM）和OptKnock预测并验证敲除靶点（如GAL7），并结合UDP-葡萄糖模块增强，最终在15-L生物反应器中实现高水平生产。
研究路线图
核心内容
本研究在酿酒酵母中实现了甜菊苷（rubusoside）和莱鲍迪苷（rebaudiosides）的从头生物合成。研究者采用模块化代谢工程策略，将完整途径划分为二萜合成、P450氧化和糖基化等模块，通过过表达限速酶tHMG1及突变体FPSF112A增强前体供应，并利用蛋白融合和RIAD/RIDD短肽标签构建底物通道，将P450酶系催化效率显著提升，steviol产量由5.3 mg/L提高至40.6 mg/L，提高7.7倍。结合AlphaFold分子对接挖掘出ABC外排泵PDR11，过表达使rubusoside产量提升129.8%；进一步过表达胁迫因子MSN4并利用基因组规模代谢模型预测敲除GAL7、过表达PGM2，解除UDP-葡萄糖供应瓶颈。最终在15-L生物反应器中，rubusoside产量达1368.6 mg/L，rebaudiosides总产量132.7 mg/L（其中Reb M为67.0 mg/L）。该研究通过系统整合前体供应、催化效率、产物转运及辅因子平衡等多维度改造，为复杂糖苷类天然产物的微生物规模化制造提供了可行范式。
创新点
['首次在酵母中实现rubusoside的克级（1368.6 mg/L）和rebaudiosides的百毫克级（132.7 mg/L）从头合成', '利用底物通道化策略（linker和RIAD/RIDD肽标签）显著提高P450酶系催化效率，steviol产量提高7.7倍', '结合AlphaFold结构和分子对接挖掘并验证PDR11为rubusoside的主要外排泵，过表达后产量提高129.8%', '应用基因组规模代谢模型和OptKnock预测代谢工程靶点，发现并敲除GAL7、过表达PGM2可解除UDP-葡萄糖供应瓶颈']
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 二萜合成模块（MVA途径） | KS | kaurene synthase | 催化 | 来自Gibberella fujikuroi，直接催化GGPP生成ent-kaurene |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 二萜合成模块（GGPP合成） | FPSF112A | 突变法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 突变体，可直接从IPP和DMAPP合成GGPP，减少FPP竞争 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | MVA途径 | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达以增强MVA途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | MVA途径 | IDI1 | 异戊烯基焦磷酸δ-异构酶 | 催化 | 过表达以增强IPP/DMAPP供应 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | P450氧化模块 | KO | ent-kaurene氧化酶 | 催化 | 来自Stevia rebaudiana，催化ent-kaurene氧化为EKA |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | P450氧化模块 | KAH | kaurenoic acid 13-羟化酶 | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，催化EKA生成steviol |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | P450氧化模块 | CPR1 | 细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 来自Stevia rebaudiana，为P450提供电子；截短TMD（trCPR1）可提高表达和催化效率 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | rubusoside合成模块 | UGT74G1 | UDP-糖基转移酶74G1 | 催化 | 来自Stevia rebaudiana，催化steviol糖基化 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | rubusoside合成模块 | UGT85C2 | UDP-糖基转移酶85C2 | 催化 | 来自Stevia rebaudiana，与UGT74G1协同合成rubusoside |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | rebaudiosides合成模块 | UGT91D2 | UDP-糖基转移酶91D2 | 催化 | 来自Stevia rebaudiana，催化rubusoside进一步糖基化；突变体e0e/e0w活性更高 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | rebaudiosides合成模块 | UGT76G1 | UDP-糖基转移酶76G1 | 催化 | 突变体MUT（T284S和I203V）提高产物特异性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | rebaudiosides合成模块 | EUGT11 | UDP-糖基转移酶91C1 | 催化 | 来自Oryza sativa，UGT91D2同工酶，经Rosetta设计提高活性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | rubusoside外排 | PDR11 | ABC转运蛋白PDR11 | 转运 | rubusoside主要外排泵，过表达显著提高产量和生物量 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 胁迫响应调控 | MSN4 | 胁迫响应转录因子Msn4 | 调控 | 过表达提高细胞对rubusoside的适应性和产量 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | UDP-葡萄糖合成 | GAL7 | 半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 | 催化 | 敲除可消除竞争反应，增加UDP-葡萄糖前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | UDP-葡萄糖合成 | PGM2 | 磷酸葡萄糖变位酶2 | 催化 | 过表达促进G6P转化为G1P，增强UDP-葡萄糖合成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 内质网调控 | INO2 | 转录因子Ino2 | 调控 | 过表达以扩大内质网，增强P450酶折叠能力 |
关键发现
- 最终在15-L生物反应器中，rubusoside产量达1368.6 mg/L，rebaudiosides总产量达132.7 mg/L（其中Reb A
- 5 mg/L、Reb D
- 2 mg/L、Reb M
- 0 mg/L）。通过底物通道化改造，steviol产量从SGN05的5.3 mg/L提高到CYP-11的40.6 mg/L，steviol/EKA比例从1:8改善至1:1.2。过表达PDR11使rubusoside产量提高129.8%至155.6 mg/L，过表达MSN4进一步提高至205.5 mg/L，敲除GAL7并过表达PGM2后达到302.1 mg/L（摇瓶水平）。此外，ent-kaurene产量在SGN03中较SGN01提高33.9倍。
研究结论
本研究通过对酿酒酵母进行系统代谢工程改造，成功实现了rubusoside和rebaudiosides的高效从头合成，建立的工程菌株和策略为复杂天然产物的微生物生产提供了可行路径，并为可持续的规模化发酵制造甜菊糖苷类甜味剂奠定了基础。