Molecular insights into the unusually promiscuous and catalytically versatile Fe(II)/α-ketoglutarate-dependent oxygenase SptF
- 作者
- Hui Tao, Takahiro Mori, Heping Chen, Shuang Lyu, Akihito Nonoyama, Shoukou Lee, Ikuro Abe
- 杂志
- Nature Communications（2022）
- DOI
- 10.1038/s41467-021-27636-3
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明高度杂泛且催化多功能的 Fe(II)/α-酮戊二酸依赖性加氧酶 SptF 的分子机制，揭示其底物杂泛性和催化多样性的结构基础。
研究策略
通过体外酶反应、18O 同位素标记、X 射线晶体学、定点突变和动力学分析，表征 SptF 的底物谱和催化机制，解析与底物复合物的三维结构。
研究路线图
核心内容
该研究通过体外酶反应、18O同位素标记、X射线晶体学、定点突变及动力学分析，系统解析了Fe(II)/α-酮戊二酸依赖性加氧酶SptF的底物杂泛性与催化多功能性的分子机制。结果显示，SptF与同源酶AndF序列一致性达94%，可接受多种美罗萜底物，并能催化连续四轮氧化反应，包括羟基化、脱饱和、环氧化及骨架重排，将terretonins转化为环丙烷稠合的5/3/5/5/6/6和5/3/6/6/6骨架，同时还能羟基化人甾体激素（如雄酮、睾酮、孕酮），转化率为34%–53%。晶体结构揭示可塑性环区是决定底物杂泛性的关键结构元件。动力学分析表明，F133A突变体对底物1的kcat/KM较野生型下降逾1000倍，N65A突变体降低14倍；18O标记实验证实环氧氧主要源于O2（97.8%），并含约5%水来源氧。这些发现揭示了SptF可塑性环区对底物识别的核心贡献，并为工程化改造该酶以应用于结构多样化合物的绿色氧化提供了结构基础。
创新点
发现 SptF 可催化连续四轮氧化反应（羟基化、脱饱和、环氧化、骨架重排）；首次报道 SptF 能将 terretonins 转化为环丙烷稠合的 5/3/5/5/6/6 和 5/3/6/6/6 骨架；并发现 SptF 可羟基化人甾体激素；通过结构解析揭示可塑性环区是底物杂泛性的关键。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 Rosetta2(DE3)pLysS | emervaridone 生物合成 | sptF | SptF | 催化 | Fe(II)/αKG 依赖性加氧酶，催化羟基化、脱饱和、环氧化和骨架重排 |
| 大肠杆菌 Rosetta2(DE3)pLysS | andiconin 来源的美罗萜生物合成 | andF | AndF | 催化 | 与 SptF 有 94% 序列同源性，生成 antidomin 7 |
关键发现
- SptF 与 AndF 有 94% 序列同源性，能接受多种美罗萜底物；对 terretonins 的转化率为 6%-51%，对甾体（androsterone、testosterone、progesterone）的转化率为 34%-53%；F133A 突变体对 1 的 kcat/KM 比野生型下降超过 1000 倍，N65A 对 1 降低 14 倍；18O 标记实验显示 3 中环氧氧主要来自 O2 (97.8%)，并有约 5% 的水来源氧；产物 4 和 5 中 +6 峰比例分别为
- 3% 和
- 7%（98% 18O2）；SptF 天然底物 1 可生成
- 3、4、5 等产物；I63A 突变体产生新产物 32；N65T 突变体改变产物比例。
研究结论
SptF 是一种异常杂泛且催化多功能的 Fe/αKG 加氧酶，其可塑性环区贡献了底物杂泛性，在结构多样的氧化反应中具有作为高效生物催化剂的潜力。