Discovery and characterization of a terpene biosynthetic pathway featuring a norbornene-forming Diels-Alderase
- 作者
- Zuodong Sun, Cooper S. Jamieson, Masao Ohashi, K. N. Houk, Yi Tang
- 杂志
- Nature Communications（2022）
- DOI
- 10.1038/s41467-022-30288-6
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析并重构sordaricin的生物合成途径，揭示天然界催化环戊二烯与烯烃亲双烯体发生Diels-Alder环化形成降冰片烯结构的酶学机制，首次发现并表征了降冰片烯合酶SdnG。
研究策略
通过基因组挖掘、异源重构（构巢曲霉和酿酒酵母）、生物转化、体外酶活测定、DFT计算以及化学合成中间体，逐步解析sordaricin生物合成中的P450氧化级联和SdnG催化的分子内Diels-Alder反应。
研究路线图
核心内容
该研究通过基因组挖掘和异源重构，在构巢曲霉和酿酒酵母中逐步解析了sordaricin的完整生物合成途径，并首次发现并表征了催化分子内Diels-Alder反应形成降冰片烯结构的酶SdnG。研究采用P450酶级联策略，依次完成双羟基化、二醇裂解、脱饱和和羧基氧化，以激活二烯与亲双烯体对。在构巢曲霉中重构时，逐步加入SdnA/B、SdnH、SdnF和SdnE后，最终sordaricin产量达到20 mg/L，酿酒酵母中为2 mg/L。动力学和DFT计算表明，P450级联中的氧化修饰将底物环化能垒从33.9 kcal/mol降至20.3 kcal/mol，使非酶环化速率提高57倍；SdnG则进一步将催化速率加速约560倍，其K_M为19 μM，k_cat为56/min。该工作揭示了自然界通过P450分子编辑为周环反应准备底物的简洁化学逻辑，扩展了pericyclase催化范围，并为sordaricin提供了可规模化的生物合成路线。
创新点
首次发现催化环戊二烯与烯烃亲双烯体成环形成降冰片烯的生物Diels-Alder酶SdnG；揭示了通过P450酶顺序性地进行双羟基化、二醇裂解、脱饱和和羧基氧化来激活二烯/亲双烯体对的简洁化学逻辑；完整重构了sordaricin的生物合成途径。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sordaria araneosa NRRL 3196 | sordaricin生物合成 | sdnA | SdnA | 催化 | 二萜环化酶，催化GGPP环化为cycloaraneosene |
| Aspergillus nidulans A1145 ΔEMADST | sordaricin生物合成 | sdnA | SdnA | 催化 | 二萜环化酶，催化GGPP环化为cycloaraneosene |
| Aspergillus nidulans A1145 ΔEMADST | sordaricin生物合成 | sdnB | SdnB | 催化 | P450多功能酶，催化cycloaraneosene的双羟基化和随后的二醇裂解 |
| Aspergillus nidulans A1145 ΔEMADST | sordaricin生物合成 | sdnC | SdnC | 催化 | GGPP合酶，增加GGPP通量 |
| Aspergillus nidulans A1145 ΔEMADST | sordaricin生物合成 | sdnH | SdnH | 催化 | P450脱饱和酶，催化环戊烷环C-12/C-13脱氢形成环戊二烯 |
| Aspergillus nidulans A1145 ΔEMADST | sordaricin生物合成 | sdnF | SdnF | 催化 | P450氧化酶，将C-8醛氧化为羧基，激活二烯用于Diels-Alder反应 |
| Aspergillus nidulans A1145 ΔEMADST | sordaricin生物合成 | sdnE | SdnE | 催化 | P450羟化酶，催化C-18甲基羟基化生成sordaricin |
| Aspergillus nidulans A1145 ΔEMADST | sordaricin生物合成 | sdnG | SdnG | 催化 | 辅因子非依赖的Diels-Alder酶（降冰片烯合酶），加速化合物10的分子内[4+2]环化 |
| Saccharomyces cerevisiae RC01 | sordaricin生物合成 | sdnA | SdnA | 催化 | 在酿酒酵母中重构sordaricin途径，产量2 mg/L |
| Escherichia coli Rosetta 2 | sordaricin生物合成 | sdnG | SdnG | 催化 | 用于SdnG异源表达与纯化，进行体外酶活表征 |
关键发现
- 在构巢曲霉中逐步重构sordaricin生物合成：表达SdnA/B产生25 mg/L的8,9-二醇2和3.5 mg/L的副产物3
- 加入SdnH后产生7 mg/L的5和4.5 mg/L的6
- 加入SdnF后产生1 mg/L的11和1 mg/L的12
- 加入SdnE后sordaricin 1产量达20 mg/L，在酿酒酵母中为2 mg/L。非酶动力学测得化合物7环化k_uncat=0.0018/min（半衰期390 min），化合物10的k_uncat=0.103/min（半衰期6.7 min），10比7快57倍
- DFT计算显示10的环化能垒20.3 kcal/mol，远低于7的27.6 kcal/mol和5的33.9 kcal/mol。SdnG体外催化10生成11，K_M=19 μM，k_cat=56/min，相对非酶反应加速约560倍
- SdnG对10的活性至少比对7高100倍。
研究结论
本研究完整解析了sordaricin从环阿兰烯（cycloaraneosene）到终产物的生物合成途径，发现并表征了首个催化降冰片烯形成的Diels-Alder酶SdnG，证明了P450级联通过分子编辑策略为分子内Diels-Alder反应准备底物，扩展了pericyclase催化反应的范围，并为sordaricin的合成提供了直接、可规模化的生物合成路线。