Screening microbially produced Δ9-tetrahydrocannabinol using a yeast biosensor workflow
- 作者
- William M. Shaw, Yunfeng Zhang, Xinyu Lu, Ahmad S. Khalil, Graham Ladds, Xiaozhou Luo, Tom Ellis
- 杂志
- Nature Communications（2022）
- DOI
- 10.1038/s41467-022-33207-x
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
微生物生产大麻素（如THC）时，构建菌株变体的能力远超筛选高产菌株的能力，缺乏低成本、高通量的检测方法；LC-MS通量低且昂贵，成为代谢工程开发的瓶颈。
研究策略
将人源大麻素受体CB2R移植到酿酒酵母中，与酵母信息素响应通路偶联，以GFP作为报告基因构建生物传感器；优化样品处理和基于酶标仪的检测流程，实现中等通量的微生物发酵液中THC的检测和相对定量，并用于筛选THCAS突变体文库。
研究路线图
核心内容
针对微生物发酵产大麻素（如THC）缺乏低成本高通量检测方法的问题，本研究将人源大麻素受体CB2R与酵母信息素响应通路偶联，构建了以GFP为报告基因的酵母生物传感器，并优化了基于酶标仪的样品处理和检测流程。该传感器对THC在0.01–10 μM范围内呈线性响应，动态范围超过6倍，重复测量标准差小于3%最大信号；在10 μM 2-AG刺激下，GFP表达变化可达60倍。利用该工作流程对108个THCAS突变菌株进行筛选，成功鉴定出5个高产THC菌株，其中4株位于LC-MS检测结果的前15%并包含最高产菌株，与LC-MS结果呈显著正相关（Pearson r=0.6，p<0.0001），样品制备成本仅约0.1美元。该生物传感器虽无法精确区分THC与THCV等结构类似物，但可作为LC-MS前的初筛工具，以极低成本实现突变体文库的高通量富集，显著加速微生物大麻素代谢工程的菌株改良进程。
创新点
['首次在酵母中实现人源CB2R与酵母Gpa1的有效偶联，构建了对多种大麻素有响应的生物传感器', '开发了优化的大麻素生物传感器酶标仪检测流程，THC检测线性范围覆盖0.01–10 μM，动态范围>6倍', '将生物传感器应用于THCAS突变体文库筛选，成功鉴定出5个高产THC菌株，并与LC-MS结果显著相关']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株yWS677/yWS2345 | 酵母信息素响应通路 | GPA1 | Gpa1（酵母Gα蛋白） | 调控 | 作为GPCR的下游信号转导蛋白，与CB2R偶联，将配体结合转化为GFP报告基因表达 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株yWS2345 | GPCR信号通路（大麻素感知） | CNR2 | CB2R（人源大麻素2型受体） | 调控 | 异源表达于酵母，负责识别大麻素配体（THC、CBD、CBG等） |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株yZ135及yS231文库 | 大麻素生物合成通路 | CsTHCAS | THCA合酶（Δ9-tetrahydrocannabinolic acid synthase） | 催化 | 催化CBGA生成THCA，文中对V415位点进行NNK突变构建突变体文库，用于筛选高产物株 |
关键发现
- 10 μM 2-AG刺激下CB2R与Gpa1组合的GFP表达变化达60倍
- AEA剂量响应Hill斜率=0.8，动态范围53倍
- THC在0.01–10 μM范围内线性响应，动态范围>6倍，重复测量标准差<3%最大信号
- 利用该生物传感器筛选108个THCAS突变菌株，鉴定出5个高产物株，其中4/5位于LC-MS前15%并包括最高产菌株，与LC-MS的Pearson相关系数r=0.6（p<0.0001）
- 样品制备成本约0.1美元/样品。
研究结论
本研究建立的基于酵母CB2受体的THC生物传感器工作流程可低成本、高通量地从微生物培养物中筛选高产THC的菌株，能够用于富集突变体文库，加速代谢工程改造；虽然无法精确区分THC与THCV等类似物，但足以作为LC-MS等精确方法前的初筛工具。