Turn air-captured CO2 with methanol into amino acid and pyruvate in an ATP/NAD(P)H-free chemoenzymatic system
- 作者
- Jianming Liu, Han Zhang, Yingying Xu, Hao Meng, An-Ping Zeng
- 单位
- 西湖大学
- 杂志
- Nature Communications（2023）
- DOI
- 10.1038/s41467-023-38490-w
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何在不依赖ATP和NAD(P)H的情况下，利用甲醇和空气捕获的CO2高效合成甘氨酸、丝氨酸和丙酮酸，克服CO2固定的热力学驱动力低、速率慢等问题。
研究策略
构建ATP/NAD(P)H-free的化学酶促系统（ICE-CAP）：用DTT的化学还原替代NADH依赖的L蛋白，为甘氨酸裂解系统（rGCS）提供热力学驱动力；通过蛋白质工程改造P蛋白的半胱氨酸二硫键和H蛋白的硫辛酰胺臂，增强酶活和反应速率；将甲醇经醇氧化酶氧化为甲醛，与空气捕获的CO2（碳酸氢盐）结合合成甘氨酸，并延伸至丝氨酸和丙酮酸。
核心内容
本研究构建了一个不依赖ATP和NAD(P)H的化学酶促系统（ICE-CAP），利用甲醇和空气捕获的CO2直接合成甘氨酸、丝氨酸和丙酮酸。核心策略是用DTT的化学还原替代NADH依赖的L蛋白，为还原性甘氨酸裂解系统提供热力学驱动力，同时通过蛋白质工程改造P蛋白的半胱氨酸二硫键和H蛋白的硫辛酰胺臂来提升酶活。DTT还原硫辛酸使整个反应的ΔG'从-1.2 kJ/mol降至-8.0 kJ/mol；用DTT替代L蛋白后甘氨酸生成速率从0.1 μM/min提高到6.4 μM/min，提升超过50倍；进一步优化后速率达到75 μM/min。该系统从空气捕获的CO2（约200 mM碳酸氢盐）合成甘氨酸17.1 mM（1.3 g/L），碳得率86%/34%；从甲醇和空气CO2合成甘氨酸13.2 mM（1.0 g/L），并延伸合成丝氨酸7.5 mM（0.8 g/L）和丙酮酸6.9 mM（0.6 g/L）。系统CO2固定速率为53.7 nmol/min/mg，比CETCH循环高10倍。该工作证明化学还原与酶催化结合可在无辅因子条件下直接从空气制造氨基酸，为CO2捕集利用开辟了新路径。
创新点
['用DTT化学还原替代NADH依赖的L蛋白，实现无辅因子CO2固定', '揭示并利用DTT对P蛋白氧化还原态的调控，防止蛋白聚合，提升羧化酶活性', '工程化H蛋白破坏硫辛酰胺臂的自我保护，显著提高反应速率', '实现从甲醇和空气捕获CO2到g/L级甘氨酸、丝氨酸和丙酮酸的合成']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 还原性甘氨酸途径 (rGlyP) / 甘氨酸裂解系统 (rGCS) | gcvH | H protein（氨基甲基载体蛋白） | 转运 | 硫辛酰胺臂在P蛋白和T蛋白之间穿梭；突变Y70A/Y70P/Y70R/Y70W可释放自我保护，提高甘氨酸合成速率。 |
| — | 还原性甘氨酸途径 (rGlyP) / 甘氨酸裂解系统 (rGCS) | gcvP | P protein（甘氨酸脱羧酶） | 催化 | 催化CO2固定关键羧化步骤；其活性受C335-C949/C951二硫键氧化还原调控，DTT可还原并激活。 |
| — | 还原性甘氨酸途径 (rGlyP) / 甘氨酸裂解系统 (rGCS) | gcvT | T protein（氨基甲基转移酶） | 催化 | 将氨甲基从H蛋白转移到THF。 |
| — | 还原性甘氨酸途径 (rGlyP) / 甘氨酸裂解系统 (rGCS) | lpd | L protein（二氢硫辛酰胺脱氢酶） | 催化 | NADH依赖酶，在本系统中被DTT还原化学替代。 |
| — | 甲醇氧化途径 | — | Alcohol oxidase（醇氧化酶） | 催化 | 将甲醇氧化为甲醛，来自Pichia pastoris。 |
| — | 甲醇氧化途径 | — | Catalase（过氧化氢酶） | 催化 | 分解AOX反应产生的H2O2。 |
| — | 甘氨酸→丝氨酸途径 | glyA | SHMT（丝氨酸羟甲基转移酶） | 催化 | 催化甘氨酸与5,10-CH2-THF生成丝氨酸，来自E. coli K12。 |
| — | 丝氨酸→丙酮酸途径 | — | LSD（L-丝氨酸脱水酶） | 催化 | 将丝氨酸转化为丙酮酸；来自Mycobacterium smegmatis的MsLSD更稳定，但对甲醛敏感。 |
关键发现
- DTT还原硫辛酸的ΔG'为-7.4 kJ/mol，使整个rGCS反应ΔG'从-1.2 kJ/mol降至-8.0 kJ/mol
- 用DTT替代L蛋白和NADH后，甘氨酸生成速率从0.1 μM/min提高到6.4 μM/min（>50倍）
- P蛋白突变C949S/C951S在无DTT时甘氨酸生成速率提高约3倍，WT P蛋白在DTT存在下提高>50倍
- H蛋白Y70突变体使甘氨酸生成速率>2倍提升（Y70W/P/R/F）
- 优化后甘氨酸生成速率达75 μM/min（H_M 60 μM）
- 从甲醛和碳酸氢盐合成甘氨酸15.5 mM（1.2 g/L），碳得率78%（甲醛）/31%（CO2）
- 从空气捕获CO2（约200 mM碳酸氢盐）合成甘氨酸17.1 mM（1.3 g/L），产率86%/34%
- 从甲醇（50 mM）和空气CO2合成甘氨酸13.2 mM（1.0 g/L），产率66%/26%
- 延伸合成丝氨酸7.5 mM（0.8 g/L）和丙酮酸6.9 mM（0.6 g/L）
- 系统CO2固定速率为53.7 nmol/min/mg，比CETCH循环高10倍、比人工淀粉合成途径高2.5倍。
研究结论
本研究证明通过整合化学还原与酶催化，可以在无ATP和NAD(P)H的条件下，利用甲醇和空气捕获的CO2高效合成氨基酸和丙酮酸，为直接从空气制造氨基酸及其衍生物开辟了新途径，展示了化学-酶法结合与蛋白质工程在CO2捕集利用中的潜力。