Biosynthesis of the highly oxygenated tetracyclic core skeleton of Taxol
- 作者
- Chengshuai Yang, Yan Wang, Zhen Su, Lunyi Xiong, Pingping Wang, Wen Lei, Xing Yan, Dawei Ma, Guoping Zhao, Zhihua Zhou
- 杂志
- Nature Communications（2024）
- DOI
- 10.1038/s41467-024-46583-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析紫杉醇生物合成中从双加氧紫杉烷到高度氧化的四环核心骨架（1β-dehydroxybaccatin VI）之间的未知步骤，包括三加氧和四加氧紫杉烷的合成途径、C9α-羟化酶、C7-乙酰转移酶以及噁丁环酯形成的酶学机制。
研究策略
采用体内（酵母细胞喂养）和体外（粗蛋白裂解物）反应相结合，对已知酶进行重新表征，基于Taxus转录组数据库筛选未表征的CYP725A和酰基转移酶，结合同位素标记（²H和¹⁸O）实验阐明噁丁环形成机制，并在工程酵母中重构完整途径。
核心内容
本研究系统解析了紫杉醇生物合成中从taxa-4(20),11(12)-diene-5α-ol到1β-dehydroxybaccatin VI高度氧化四环核心骨架的完整途径。作者综合运用酵母体内喂养和粗酶体外反应，结合Taxus转录组数据库筛选，鉴定出多个关键酶：新发现的taxoid 9α-羟化酶CYP725A37催化C9α位羟基化，乙酰转移酶ATS负责C7位乙酰化，而CYP725A55则通过级联氧化-协同酰基重排机制催化噁丁环酯的形成。同位素标记实验证实该重排为协同过程，C4乙酰氧基来源于C5乙酰氧基且¹⁸O完全保留。研究还首次阐明了三加氧紫杉烷的第二、第三羟基化反应顺序，成功合成了中间体7和10。最终在工程酵母YDBVI中共表达12个基因，实现了从底物2到1β-dehydroxybaccatin VI的完整生物合成，以2为底物时16为主要产物。该工作填补了紫杉醇途径中多个未知酶学步骤的空白，为最终实现紫杉醇的全生物合成奠定了基础。
创新点
['首次阐明三加氧紫杉烷的生物合成途径，确定了第二、第三羟基化反应顺序', '新发现taxoid 9α-羟化酶CYP725A37', '新发现CYP725A55催化噁丁环酯形成，提出并验证级联氧化-协同酰基重排机制', '发现C7-乙酰转移酶ATS', '在工程酵母中实现从2到1β-dehydroxybaccatin VI的完整生物合成']
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 紫杉醇生物合成途径 | T13OH | taxoid 13α-hydroxylase | 催化 | 催化C13羟基化，将2转化为5 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | T5AT | taxoid 5-O-acetyltransferase | 催化 | 催化C5乙酰化（5→6），也可催化11的C9/C10乙酰化生成12 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | TAX19 | taxoid acetyltransferase | 催化 | 催化C13乙酰化，将6转化为9 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | T10OH | taxoid 10β-hydroxylase | 催化 | 催化C10羟基化（6→7，9→10） |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | CYP725A37 | taxoid 9α-hydroxylase | 催化 | 新鉴定，催化10的C9α-羟基化生成11 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | T7OH | taxoid 7β-hydroxylase | 催化 | 催化C7羟基化，参与12→13 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | T2OH | taxoid 2α-hydroxylase | 催化 | 催化C2羟基化，参与12→13 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | TBT | taxoid 2α-O-benzoyltransferase | 催化 | 催化13的C2-OH苯甲酰化 |
| 酿酒酵母/大肠杆菌 | 紫杉醇生物合成途径 | ATS | acetyltransferase ATS | 催化 | 新鉴定，催化13的C7-OH乙酰化生成15；在大肠杆菌中筛选发现 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | CYP725A55 | taxoid oxetane-forming P450 | 催化 | 新鉴定，催化15形成噁丁环酯16和环氧化物17 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | TCPR | Taxus cytochrome P450 reductase | 催化 | 为P450提供还原力 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | AAE4 | acyl-activating enzyme | 催化 | 催化苯甲酸生成苯甲酰-CoA |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | TS | taxa-4(5),11(12)-diene synthase | 催化 | 催化GGPP环化生成taxa-4(5),11(12)-diene |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | T5OH | taxoid 5α-hydroxylase | 催化 | 催化C5α-羟基化，生成2 |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | GGPPs | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 提供二萜前体GGPP |
| 酿酒酵母 | 紫杉醇生物合成途径 | T10OH2 | taxoid 10β-hydroxylase 2 | 催化 | 与T10OH功能相似 |
关键发现
- 确定了紫杉醇生物合成中第二、第三羟基化反应顺序，成功合成三加氧紫杉烷7和10
- 从Taxus cDNA文库中鉴定出CYP725A37为新的taxoid 9α-羟化酶，催化10生成9,10-脱乙酰紫杉醇(11)
- 鉴定出CYP725A55催化2α-苯甲酰氧基-7β-乙酰氧基紫杉醇(15)生成1β-dehydroxybaccatin VI (16)及其环氧化物17，通过级联氧化-协同酰基重排机制形成噁丁环酯
- 同位素标记实验证明C4乙酰氧基来源于C5乙酰氧基，且¹⁸O完全保留，表明重排为协同过程
- 发现乙酰转移酶ATS催化13的C7-OH乙酰化生成15
- 在工程酵母YDBVI中，共表达12个基因（T13OH、T5AT、TAX19、T10OH、CYP725A37、T2OH、T7OH、AAE4、TBT、ATS、CYP725A55、TCPR），实现了从taxa-4(20),11(12)-diene-5α-ol (2)到1β-dehydroxybaccatin VI (16)的完整生物合成，以2为底物时16为主要产物（而以15为底物时16与17的比例为1:1）。
研究结论
本研究系统阐明了从taxa-4(20),11(12)-diene-5α-ol到1β-dehydroxybaccatin VI的完整生物合成途径，包括三加氧和四加氧紫杉烷的合成、C9α-羟化、C7-乙酰化和噁丁环酯形成的关键酶和机制，为紫杉醇全生物合成途径的最终解析奠定了基础。